利用人工锌指核酸酶的高效多位点基因打靶研究

设计、筛选和鉴定能够特异识别并切割人rDNA间隔序列的锌指嵌合核酸酶，结合申请者建立的多位点基因打靶技术，利用腺病毒载体构建包括一对锌指嵌合核酸酶和β珠蛋白基因的真核表达元件、同源重组引导序列的三元多位点基因打靶载体。将腺病毒打靶载体转染人胚肺成纤维细胞，腺病毒载体游离表达锌指嵌合核酸酶，锌指嵌合核酸酶诱导rDNA间隔序列特异性双链断裂及高效基因打靶。不经药物筛选的基因定点整合效率有望超过18％，将解决基因打靶时基因定点整合效率低的问题；靶位点位于活跃的转录单位内，故可解决转基因时外源基因不能稳定表达的部分问题；靶位点为基因间的间隔序列，克服了毒性整合等安全性问题。突破了重复序列不能作为外源基因整合靶位点的禁区。以β地中海贫血为模型，将为遗传病的基因治疗建立新的通用技术平台；率先在人类建立以重复序列为靶位点的高效多位点基因打靶技术，国内外尚无类似研究的报道。