反义锁核酸诱导恶性疟原虫基因沉默的研究

疟原虫基因功能研究的重点技术中，基因敲除技术难度大，普及率相对不高，RNA干扰机制则缺乏酶学基础，存在广泛争议，常规反义核酸技术诱导基因沉默效率较低。在其他真核细胞中，"LNA-gapmer"反义锁核酸诱导基因沉默的效率接近于RNA干扰，大大高于反义核酸。但该技术在疟原虫相关领域中的研究则未见报道。本研究拟采用锁核酸，设计针对恶性疟原虫红内期必需和非必需基因、报告基因GFP及具有自主知识产权的Pfdynamin1和Pfmag1基因的"LNA-gapmer"反义锁核酸，并与磷硫酰反义核酸对比，通过分子、生化等手段检测基因沉默的效率。本研究首次采用反义锁核酸技术沉默疟原虫基因，探讨"LNA-gapmer"反义锁核酸诱导恶性疟原虫基因沉默的效果及效率，有望为疟原虫基因功能研究提供新手段。该技术的应用，同时将进一步揭示Pfdynamin1和Pfmag1这两个关键基因在疟原虫红内期的重要作用。

疟原虫基因功能研究的重点技术中，基因敲除技术难度大，普及率相对不高，RNA干扰机制则缺乏酶学基础，存在广泛争议，常规反义核酸技术诱导基因沉默效率较低。在其他真核细胞中，“LNA-gapmer”反义锁核酸诱导基因沉默的效率接近于RNA干扰，大大高于反义核酸。但该技术在疟原虫相关领域中的研究则未见报道。本研究通过反复实验，获得以下成果：第一，明确了已报道文献中的方法学错误，证实普通孵育法转染反义核酸进入恶性疟原虫的效率低下，其所谓针对必需基因的反义核酸能够抑制恶性疟原虫的生长是一种非特异现象；第二，证实某些小分子RNA的转染试剂(Entraster R)能够有效地将反义核酸转染进入培养的恶性疟原虫中，其转染效率与疟原虫的生长周期密切相关；第三，针对报告基因GFP，设计了“LNA-gapmer”反义锁核酸，并通过新型细胞穿透肽技术，将反义锁核酸高效转染进入恶性疟原虫，并通过分子、生化、影像等手段检测了基因沉默的效率，明确了反义锁核酸诱导恶性疟原虫基因沉默的有效性和快速性；第四，获得了Pfdynamin1基因敲除的稳定转染子，但全长敲除致死。本研究基本达到了项目的预期目标，第一次证实了 “LNA-gapmer”反义锁核酸能够快速诱导恶性疟原虫基因沉默，是疟原虫基因功能研究的新手段。