EZH2在肾癌细胞生长侵袭与耐受TRAIL凋亡诱导中作用与机制的研究

TRAIL通过与其受体DR 4或DR 5结合，选择性杀伤肿瘤细胞而对正常细胞无细胞毒作用。但肾癌细胞可以耐受TRAIL的凋亡诱导作用，其机制是学者研究的热点。EZH2通过DNA甲基化使目的基因沉默而促进肿瘤的发生发展，但其在肾癌中的作用目前尚不清楚。本研究拟分别构建可稳定高表达EZH2的Caki-1/EZH2细胞克隆与稳定低表达EZH2的Caki-2/shEZH2细胞克隆，观察EZH2的表达变化对肾癌细胞的生长与侵袭能力的影响；检测Caki-1与Caki-2细胞DR 4与DR 5启动子区域甲基化水平及EZH2的结合水平，观察EZH2表达变化对DR 4与DR 5启动子DNA甲基化的影响，对比研究EZH2表达变化对DR 4、DR 5蛋白表达变化的影响与TRAIL诱导肾癌细胞凋亡能力的影响，初步探讨EZH2在肾癌细胞耐受TRAIL凋亡诱导中的作用，为寻找肾癌新的治疗靶点提供理论依据与实验基础。

TRAIL通过与其DR4或DR 5结合，选择性杀伤肿瘤细胞而对正常细胞无细胞毒作用，是理想的肿瘤治疗靶点。但肾癌细胞可以耐受TRAIL的凋亡诱导作用，其机制尚不清楚，是学者研究的热点。EZH2通过DNA甲基化使目的基因沉默而促进肿瘤的发生发展，但其在肾细胞癌（RCC）中的作用目前尚不清楚。本研究首先鉴定了EZH2在肾癌组织与正常肾组织中的表达情况，随后分别构建可稳定高表达EZH2 的769-P/EZH2 细胞克隆与稳定低表达EZH2 的786-O/shEZH2与ACHN/shEZH2细胞克隆，观察EZH2的表达变化对肾癌细胞的生长与侵袭能力的影响。结果提示，高表达EZH2可提高769-P细胞的体外生长能力，促进细胞进入S期，并可增强其体外侵袭能力，而下调EZH2后可降低786-O细胞的体外生长速度，将细胞阻滞在G1/S期，并可降低其体外侵袭能力。Real time PCR结果提示上调EZH2的表达可显著抑制RCC细胞中TIMP-1的表达水平，而TIMP-2，-3，-4的表达水平没有显著性变化，而下调EZH2的表达后RCC细胞中MMP-9的表达水平也显著下降，MMP-2的活性则没有显著性变化，提示EZH2可影响MMP-9/TIMP-1之间的平衡，促进RCC细胞的侵袭转移。进一步的研究发现，786-O与ACHN并不表达DR4与DR5，而应用shRNA下调786-O与ACHN细胞中EZH2的表达水平后，其DR4、DR5的表达显著上调，且恢复了对TRAIL凋亡诱导的敏感性，提示DR4与DR5的表达沉默是导致RCC细胞耐受TRAIL凋亡诱导的重要原因。甲基化特异性PCR发现 786-O与ACHN均可检测到DR4、DR5启动子的甲基化，而下调EZH2后其甲基化水平显著下降，提示EZH2可是DR4、DR5启动子甲基化，导致其表达沉默，可能是RCC细胞耐受TRAIL凋亡诱导的重要原因。我们检测了EZH2对RCC细胞体外生长能力的作用后，进一步检测了EZH2对RCC细胞体内生长能力的影响。结果提示在下调了EZH2的表达后，RCC细胞裸鼠体内生长能力显著下降。综上所述，我们认为EZH2对RCC的发生、发展起到重要的促进作用，可能成为RCC有效的治疗靶点，并可能成为TRAIL治疗RCC的重要辅助治疗策略。