细菌双组分信号转导系统HisKA家族蛋白去磷酸化调控机制的NMR研究

Two-component systems are wildspread in pathogens. A typical TCS in its simplest form consists of a sensor histidine kinase (HK) and a response regulator (RR). They play important roles in sensing and responding to environmental changes through the phosphoryl group transfer between HK and its cognate RR. Although the general phosphorylation signaling pathway has been described for many TCSs, the molecular mechanism of the dephosphorylation process remains elusive. The goal of this project is to utilize the metal fluoride probes to investigate the dephosphorylation process of response regulator catalyzed by the bifunctional histidine kinase. HK853-RR468 and PhoR-PhoB are representative proteins in HisKA subfamily which were chosen as model systems in our project. The multi-dimensional 19F-NMR experiments will be established in combination with dynamics measurement, isotope labeling, point mutation and biochemical techniques for the exploration of transient interactions between domains. The main purpose of this study is to detect the key residues in the dephosphorylation process and find the relationship between structure dynamics and reaction kinetics. The results will give insights to the molecular mechanisms of the dephosphorylation process in bacteria and help us understand the signal regulation of TCS system.

双组分信号转导系统广泛存在于致病菌细胞中，是新型药物研究的热门靶点，它通过组氨酸激酶和反应调节蛋白之间的磷酸传递来调控细胞的信号转导。其中组氨酸激酶催化的反应调节蛋白去磷酸化是细菌调节胞内磷酸化水平，抑制信号交叉串扰的有效途径，对细菌毒力的调节和抗生素抗性的产生具有重要影响，因此，研究双组分系统的去磷酸化调控机制具有非常重要的生物学意义。本项目拟以HisKA家族的代表性蛋白HK853-RR468和PhoR-PhoB为研究对象，利用特异性的金属氟化物探针，结合NMR动力学实验，辅以同位素标记、基因突变、功能鉴定等多种技术手段，研究去磷酸化反应过程中蛋白结构域之间的相互作用。确定互作界面的关键氨基酸或结构片段，揭示蛋白结构的动态变化与去磷酸化速率之间的关系，为阐明去磷酸化反应的分子机制提供基础数据，促进我们对双组分信号转导系统的蛋白结构与功能及其调控机制的理解。

双组分信号转导系统广泛存在于致病菌细胞中，通过组氨酸激酶和反应调节蛋白之间的磷酸传递来调控细胞的信号转导，是新型药物研究的热门靶点。项目围绕双组分信号转导机制展开了以下几个方面的研究：细菌HisKA家族蛋白去磷酸化的分子机制；组氨酸激酶DHp结构域HxxxT基序对磷酸酶活性的调控；组氨酸激酶CA结构域的抑制剂筛选；反应调节蛋白PhoB的动态构象变化和磷酸活化动态机理。项目发展了以金属氟化物为磁共振原子探针的检测方法，捕获了组氨酸激酶与反应调节蛋白复合物的瞬态构象，发现复合物的空间构象和生物活性受pH调控，提出pH介导的蛋白去磷酸化机制；确定了HisKA家族蛋白参与去磷酸化反应的关键氨基酸位点和结构片段HxxxT基序，阐明了H和T残基协同调控蛋白磷酸酶活性的分子机制；针对组氨酸激酶CA结构域ATP结合位点筛选小分子抑制剂，解析其抑制活性的分子机制；运用核磁共振方法研究了反应调节蛋白PhoB磷酸化结构域在溶液中的多种二聚形态，其二聚形式的变化与蛋白质的磷酸化生物功能密切相关。研究成果为阐明超级细菌信号转导的分子机制提供了基础数据，促进我们对蛋白质的结构、功能及其调控机制的理解。. 项目开发的19F磁共振原子探针灵敏度强，不仅能精确定位蛋白相互作用的活性位点，还能反映蛋白质互作界面的精细构象变化，是蛋白质互作分子机制研究的有力工具。项目还发展了05SAR-PAGE电泳方法，直接检测蛋白质的二聚状态，磷酸化修饰和甲基化修饰，成本低，操作简单，有望用于研究细胞内翻译后修饰，膜蛋白复合物、高聚物等生物大分子的分离鉴定，有较高的推广价值。