氧化应激中热休克蛋白90对MRN复合物相关的DNA双链断裂损伤修复通路的调控机制

Environmental stimuli induce oxidative stress and directly lead to DNA double strand breaks (DSBs) and protein oxidative damage.Hsp90 is vital to keep the protein homeostasis, and many client proteins of Hsp90 are the key molecules, which are critical for DSBs repair. MRE11-RAD50-NBS1 (MRN) complex is the important initial sensor and adaptor for the DSBs repair procedure. Meanwhile, how Hsp90 assists the MRN related DSBs repair is still unknown. Our results indicate,Hsp90αis related to the decrease of MRN protein level, and exacerbates DSBs damage induced by oxidative stress. Hence, we will take MRE11/RAD50/NBS1 as the target, monitor the MRN activity by EMSA and ChIP-seq, and focus on the level, modification status, cochaperone, ATPase activity of Hsp90 to explore the role of Hsp90 in MRN related DSBs damage/repair induced by oxidative stress.

多种环境刺激因素均可诱导氧化应激，从而导致DNA双链断裂损伤和蛋白质氧化损伤。分子伴侣Hsp90是蛋白质质量控制的重要分子，其多种底物蛋白与DNA双链损伤修复通路密切相关。MRE11-RAD50-NBS1（MRN）蛋白复合物是DNA双链断裂损伤修复通路的重要始动因子，但氧化应激下Hsp90对其协同调控机制亟待阐明。本课题组前期定量蛋白质组学结果表明：Hsp90α敲除株伴随MRN蛋白水平下降，氧化应激诱导的DNA双链断裂损伤加重。因此，本课题将MRN复合物作为底物蛋白，以CRISPR-Cas9技术建立Hsp90敲除及表达Hsp90ATPase 突变体细胞株，应用凝胶迁移实验和ChIP-seq检测MRN复合物的活性。从影响Hsp90 分子伴侣功能的四要素：量、修饰状态、共伴侣蛋白、ATPase 活性，阐明氧化应激中Hsp90 对MRN蛋白复合物相关DNA双链断裂损伤修复通路中的调控作用。

多种环境刺激因素均可诱导氧化应激，从而导致DNA双链断裂损伤(DSBs)和蛋白质氧化损伤。分子伴侣热休克蛋白90（Heat Shock protein 90, Hsp90）是蛋白质质量控制的重要分子，其多种底物蛋白与DNA双链损伤修复通路密切相关。MRE11-RAD50-NBN复合物是DNA双链断裂损伤修复通路的重要始动因子。已知Bcl-2相关转录因子(BCL2-associated transcription factor, Bclaf1)是Hsp90底物蛋白，同时DDR调控通路的关键调控因子。因此，Hsp90是否协同Bclaf1共同通过调控 MRN 复合物活性，进而影响氧化应激下的DSBs损伤修复，其机制有待探讨。本研究发现，在H2O2诱导的氧化应激下使细胞发生DNA双链断裂损伤，且Hsp90α敲除的HepG2细胞DNA损伤、细胞增殖抑制、G2/M期阻滞及细胞凋亡程度加重。短时程氧化应激下，MRN复合物与γ-H2AX形成的DNA损伤修复灶点增多，但Hsp90α敲除的HepG2细胞中MRN及γ-H2AX形成的DNA损伤修复灶点减少。Hsp90α敲除影响HepG2细胞和MDA-MB-231细胞中DNA损伤修复通路关键蛋白表达及关键基因的转录，氧化应激下尤甚。HSP90C端抑制剂新生霉素下调Bclaf1水平、NBN表达及抑制细胞的DNA损伤修复反应，Bclaf1基因敲低结果与上述结果一致。Bclaf1和Hsp90α均能特异性结合在NBN启动子区域，调控其转录。Hsp90α敲除抑制氧化应激后NBN在γH2AX foci的聚集。全基因组外显子测序显示氧化应激及新生霉素均能使突变率增高，提示NBN下调对同源重组和非同源末端连接通路的选择性的潜在影响。上述结果提示：氧化应激下，Hsp90α经由BCLAF1调控NBN的转录，并抑制经由同源重组通路的DNA双链断裂损伤修复通路。