FOXO1调节miR-506表达在胶质母细胞瘤间质转化中的作用研究

Integrated genomic analysis of glioblastoma (GBM) performed by TCGA identifies four clinically relevant molecular subtypes, in which the mesenchymal subtype has worst prognosis. Basic researches indicated that the dismal prognosis is closely related with the malignant biological properties induced by glial-mesenchymal transition (GMT) of GBM. But molecular mechanism of GMT is still not clear and the characterized molecule of GBM has not been studied yet. FOXO1 is at a convergence point of receptor tyrosine kinase (RTK) signaling, which is one of the three core pathways implicated in GBM. Our researches have proved that inactivation of FOXO1 is an independent prognosis factor of GBM and pre-experiment indicated that FOXO1 is involved in the inhibition of GMT and miR-506 is likely to be the downstream molecular. In this program, we will further confirm the role of FOXO1 in GMT through cytological experiments and nude mice orthotopic glioblastoma models. GBM tissues will be classified into TCGA subtypes through immunohistochemical method. We will analysis the clinical relevance of FOXO1 expression and their relationships with mesenchymal subtype. Chromatin immunoprecipitation will be adopted to elucidate the mechanism of regulation of miR-506 expression by FOXO1 and cytological experiments to elucidate its role on GMT. Our study is aimed at clarifying how FOXO1 regulates GMT and its clinical significance, which provides new idea for mesenchymal GBM treatment.

TCGA等研究显示间质亚型胶质母细胞瘤（GBM）预后极差，基础研究显示这与胶质-间质转化（GMT）诱导GBM细胞恶性生物学行为密切相关。目前GMT的分子机制仍不明确，尚无针对GBM核心信号通路中分子的研究。FOXO1位于GBM核心通路RTK通路的节点位置，我们前期研究证明FOXO1失活是GBM独立预后因素，细胞学实验高度提示FOXO1可抑制GMT，而miR-506很可能是其下游分子机制。本项目拟通过细胞实验和裸鼠颅内原位成瘤模型实验明确FOXO1抑制GMT的功能；通过免疫组化对GBM标本作TCGA分型，结合临床资料分析FOXO1表达、间质亚型、预后三者之间的相关性，明确FOXO1调控GMT的临床意义；通过染色质免疫共沉淀等技术，探索FOXO1调节miR-506表达的机制以及对GMT的影响。本研究旨在阐明FOXO1调控GMT的功能、临床意义及下游分子机制，为间质亚型GBM治疗提供新的思路。

已有研究表明间质亚型胶质母细胞瘤（GBM）预后极差与胶质-间质转化（GMT）诱导GBM细胞恶性生物学行为密切相关。我们前期的研究表明位于GBM核心通路RTK通路上的FOXO1失活是GBM独立预后因素，细胞学实验结果显示FOXO1可抑制GMT，而miR-506很可能是其下游分子机制。本研究在前期的基础上，探索FOXO1和miR-506的作用机制以及其对GMT的影响，阐明FOXO1调控GMT的功能、临床意义及下游分子机制，为间质亚型GBM治疗提供新的思路。本课题通过免疫组化对GBM标本作TCGA分型；在体外细胞水平上，用慢病毒筛选稳定表达FOXO1胶质瘤细胞株；划痕/Transwell 检测迁移/侵袭；粘附实验以及qRT-PCR和Western blot检测间质转化标志物的mRNA和蛋白表达水平；单克隆形成实验检测细胞增殖；细胞毒性实验检测肿瘤细胞对化疗药物的敏感性；流式细胞仪检测细胞的凋亡和细胞干性标志物阳性率；电镜观察细胞自噬；裸鼠颅内胶质瘤原位模型，观察动物生存期；皮下菏瘤动物观测化疗药物干预下的肿瘤生长。本研究的结果证实FOXO1能够在体外细胞水平抑制GBM 细胞增殖、迁移和侵袭、肿瘤细胞干细胞性以及促进体内菏瘤动物模型、体外细胞模型化疗药物替莫唑胺、BCNU 和顺铂敏感性；尽管FOXO1过表达稳转株miR-506的表达与FOXO1表达的正相关趋势不显著，生物信息学分析与CHIP实验结果未能确证FOXO1与miR-506正相关调控关系，而FOXO1过表达瞬转胶质瘤细胞以及新鲜肿瘤组织miR-506表达随FOXO1表达升高而上调。我们对 miR-506进行的体外细胞实验结果表明：miR-506可能是通过靶向作用于beclin-1从而抑制肿瘤细胞的自噬，促进肿瘤细胞发生GMT前期的失巢凋亡。本研究的结果提示FOXO1能够促进肿瘤对化疗药物的敏感性；miR-506能抑制自噬促进凋亡；FOXO1与miR-506能够抑制肿瘤发生GMT相关的转移。近年来，在研以及进入临床研究阶段的miRNA药物成上升趋势，miRNA易降解的不稳定性是其作为药物开发应用面临的难题。我们研究中发现的FOXO1过表达转染早期瞬转肿瘤细胞miR-506相应的表达增加为FOXO1- miR-506有望作为潜在的新药开发提供启示。