低分化肝细胞肝癌的豪猪信号活性及上皮细胞间质转化

One characteristic of cancer stem cells is insensitivity to chemo or radiotherapy. CD133, EpCAM and ALDH are often used as CSC or initiating cell markers for tumors from epithelial origins. However, poorly-differentiated HCC is often chemoresistant, and CSC marker-negative. Our preliminary data indicate that these features of HCC correlate with the occurrence of epithelial mesenchymal transition (EMT) and enhanced hedgehog (Hh) signaling activity. Therefore, the objective of this proposal is to determine the correlation between EMT, Hh signaling activity and chemoresistance and progressive metastases. The primary hypothesis is that enhanced Hh signaling and EMT are the central molecular basis responsible for the insensitivity of chemotherapy and metastasis in poorly-differentiated HCC. Two specific aims are designed to test the hypothesis. Aim 1 is to separate HCC cells into various subpopulations according to CSC marker profile and determine EMT status in each subpopulation; and Aim 2 is to elucidate the controlling of EMT, chemoresistance and aggressive metastases by Hh signaling activity in poorly-differentiated HCC. Significance: The separation of HCC cells into subpopulations according to their CSC marker profile and the determination of EMT status and Hh signaling activity in their subpopulations aid well in identifying new molecular targets, eradicating chemo-resistant subpopulations for the improvement of treatment outcome in advanced or refractory HCC.

癌症干细胞（CSCs）的特点是对化疗或放疗不敏感。CD133、EpCAM和乙醛脱氢酶（ALDH）是识别上皮起源肿瘤CSCs的常用标记，CD133+/ALDH高或CD133+/EpCAM+细胞常为分化良好HCC CSC或起始亚群。然而，这些标记在大多数低分化HCC细胞中却是阴性。我们的初步研究表明上皮细胞间质转化（EMT）与阴性CSC标记物表达谱具有良好的相关性，而且低分化HCC特征与EMT和豪猪（Hh）信号活性的增强直接相关。因此，本标书的目标是确定EMT、Hh信号活性与化疗耐药性、转移之间的关系。我们的假设是EMT和Hh信号活性的增强是低分化HCC化疗不敏感和转移的重要分子机制。具体目标：1）根据CSC标记物谱将HCC细胞分成不同亚群，阐述EMT在不同肝癌细胞亚群的作用；2）阐明豪猪信号通路对调节低分化HCC细胞EMT、肿瘤进展和转移的影响。

本立项旨在探索豪猪信号通路介导低分化型肝癌转移和耐药的分子基础。首先，我们确定肝癌细胞表面分子CD133/EpCAM双阴性亚群表现出低分化趋势，呈上皮间质转化，具有很高的豪猪信号活性。但这一亚群细胞表面标记不稳定，分选后经传代即失去其表面分子标记谱，返回到未分选Huh-7细胞状态。为解决这一难题，我们将Huh-7双阴性亚群经移转培养装置筛选，得出高转移Huh-7-Trans亚群。这一亚群的特点为高豪猪信号活性、高转移及上皮间质转化，金属基质蛋白酶的表达水平及活性都很高，这为剖析豪猪信号通路如何调控肝癌细胞转移特性奠定了基础。同时，此亚群稳定细胞表面分子表达谱及生物学特性也成为研究肿瘤转移及干预的有用工具。我们应用豪猪信号通路中关键分子SMO的阻止剂LDE225处理此亚群，发现对该亚群的高转移特性有不同程度的抑制作用。特别值得关注的是豪猪信号通路转录因子Gli-1的剪切体tGli-1出现于Huh-7-Trans亚群中，也出现于本地高转移的肝癌细胞株如SMCC-7721、MHCC-97H和 MHCC-97L。他人在别的系统已证实该剪切体tGli-1参与调控起转移作用的基因，如金属基质蛋白酶组分等。在此基础上，为揭示豪猪信号通路与耐药间的关系，我们还从双阴性亚群中分选出Huh-7-DN亚群。该亚群除具有高豪猪信号水平、上皮间质转化、稳定细胞表面标记外，表现出对索拉菲尼的高度耐药。经检测ABC多重耐药基因，发现ABCC1的表达与豪猪信号通路中Gli-2转录因子的表达相一致。用LDE225或RNA干扰技术抑制Gli-2的表达后，ABCC1的基因表达相应下降。因此，现有的数据证实ABCC1是Gli-2的下游靶基因之一，同时也确认豪猪信号通路对该亚群耐药特性的调控作用。为进一步揭示Huh-7-Trans和Huh-7-DN的共性与差别，特别是豪猪信号通路如何调控不同的基因群以达到对转移及耐药这两个肿瘤治疗中棘手难题，我们对这两亚群做了RNA-Seq分析，除发现这两亚群与其原始Huh-7细胞在基因表达谱有显著差异外，已找到一个控制转移又调控耐药的基因，TAP1。初步的CHIP结果表明TAP1与ABCC1 均为Gli-1或Gli-2 的下流靶基因。因此，本立项揭示豪猪信号通路为肝癌转移及耐药的分子基础，豪猪信号通路分子已成为肝癌的生物标记及药物靶点。LDE225已被FDA批准为基底细胞