蒙药乳腺-I号通过CRYAB蛋白调节内质网应激通路治疗实验动物乳腺增生症机制研究

Mammary hyperplasia accounting for 75 % of all breast diseases may become cancer in the course of continuous and progressive evolution. The results in previous study showed that RX-I could treat mammary hyperplasia by improving the pathological status of mammary gland, regulating the level of serum sex hormone and reducing the expression of estrogen and progesterone receptor in mammary gland, moreover, the proteomics technique was used to find out the different protein points associated with the therapeutic effect of Mongolian medicine RX-I. Further research has found that RX-I may be able to regulate the stress pathway of endoplasmic Reticulum through CRYAB in the heat shock protein family to treat mammary hyperplasia. In this study, the effects of RX-I on CRYAB protein, on apoptosis pathway induced by endoplasmic Reticulum stress and oxidative stress, and the relevance to the effects were investigated and by flow cytometry, WB, Rt-PCR and immunohistochemistry, meanwhile, the effect of CRYAB protein on stress pathway of endoplasmic Reticulum during the development of mammary hyperplasia was explored. The mechanism of CRYAB protein on apoptosis induced by endoplasmic Reticulum stress and oxidative stress was tested in mammary epithelial cells by molecular biology techniques of cell culture and RNA interference and so on.

乳腺增生病占全部乳腺疾病的75％，在连续渐进的演变过程中可能发生癌变。前期实验研究表明蒙药乳腺-Ⅰ号(RX-I)可通过改善乳腺组织病理状况，调节血清性激素水平，降低乳腺组织雌、孕激素受体表达等作用治疗乳腺增生，而且通过蛋白质组学技术找到与蒙药乳腺-I 号治疗作用相关的多个差异蛋白点。深入研究发现RX-I可能通过热休克蛋白家族中的CRYAB蛋白调控内质网应激通路来实现治疗乳腺增生症。本课题拟通过流式细胞术、WB、Rt-PCR、免疫组织化学等技术探索RX-I对雌激素诱导的大鼠乳腺增生作用不同时间点CRYAB蛋白的调控作用；对内质网应激和氧化应激诱导的细胞凋亡通路的影响；及与疗效之间的相关性；探索在乳腺增生发生发展过程中CRYAB蛋白对内质网应激通路的调节作用；并利用细胞培养、RNA干扰等分子生物学技术在乳腺上皮细胞中验证CRYAB蛋白对内质网应激和氧化应激诱导的细胞凋亡的机制。

本研究在以往研究基础上，进行了多个方面，多个角度的研究。研究结果证实：1）RX-I可能通过下丘脑-垂体-性腺轴的负反馈调节以平衡血清性激素水平，从而有效地缓解HMG。RX-I低、中、高剂量组在不同程度上降低HMG大鼠乳头的直径与高度，改善了HMG大鼠乳腺小叶与腺体的数量与体积，表明RX-I对雌激素与孕激素诱导的HMG大鼠有很好的治疗作用；2）针对具有高维稀疏、小样本等特点的Wistar雌鼠代谢组学数据，课题组提出了一种DBN、Softmax分类器、L-BFGS与dropout方法相结合的模型，完成了CG、MG和RG代谢组学数据的分类工作。在正谱和负谱代谢组学数据五倍交叉验证分类实验中，课题组采用的模型与SVM、KNN和BPNN的分类结果进行比较，实验结果表明课题组提出的方法能够得到较好的分类效果，且该方法稳定、可靠，适用于完成该代谢组学数据的分类任务；3）RX-I通过调节两种膜联蛋白ANXA1和ANXA2以及翻译调节肿瘤蛋白(TCTP)改变乳腺增生的大鼠乳腺组织结构，下调PCNA和VEGF的表达，从而起到治疗大鼠乳腺增生症的作用。TCTP蛋白与大鼠HMG的发生发展紧密相关，并可能是RX-I治疗HMG的靶标蛋白之一，其机制可能是通过TCTP调节细胞凋亡通路；4）RX-I动态的增加了HMG大鼠的ERS标记物GRP78与CHOP表达下调水平，而降低了CRYAB蛋白的上调水平，这提示乳腺组织可能发生了ERS，诱导消除了CRYAB蛋白的表达。相比HMG组，在RX-I各治疗组中，Bcl-2/Bax比值降低，提示Bcl-2表达量不能抵消凋亡蛋白Bax表达量。然而，ERS下CRYAB蛋白降低可能减弱Bcl-2的抗凋亡能力，从而诱导细胞凋亡，CRYAB蛋白也被鉴定为ERS诱导的细胞凋亡的重要调节因子。大鼠经雌激素与孕激素诱导后GRP78、PERK和CHOP表达下调，而经乳腺-Ⅰ号药物治疗后其表达量升高，提示乳腺-Ⅰ号促进GRP78/PERK/CHOP的激活,这表明乳腺-Ⅰ号可激活ERS通路促进增生的乳腺细胞凋亡。RX-I可通过动态改善乳腺组织病理状况，调节血清性激素水平，RX-I可能通过热休克蛋白家族中的CRYAB蛋白调控内质网应激通路来实现治疗乳腺增生症。