E21R突变增强血清环境中人α防御素5抗病原微生物活性的分子机制与生物学意义

Human defensins,a kind of small cationic peptides produced endogenously, are of significant interest to be developed into a new generation of antibiotics due to their specific antimicrobial properties. However, the antimicrobial activities of defensins were dramatically decreased in serum and other complicated conditions, which encumbers the exploitation and clinical application of defensins. Recently, through in vitro evolution and selection in a study supported by NSFC,we obtained a mutant of human αdefensin 5(HD5)termed HD5-E21R, with glutamic acid residue(E) substituted by arginine residue (R)at position 21. Compared with natural HD5, HD5-E21R displays much higher antibacterial and antiviral activities even in the conditions with high concentration of serum.According to the crystal structure and distribution of charged residues, we presume that E21 is a sensitive region for HD5 to be influenced by salt and serum protein during antimicrobial actions. Therefore,in this study by application of HPLC, surface plasmon resonance (SPR) assay, site mutation and crystal structure analyse, we plan to investigate the effects of E21R mutation on the changes of electric charge and distribution of HD5, as well as serum protein binding and blocking to HD5. Based on the discoveries, subsequent experiments will be carried out to search for more effective HD5 mutant by adding new potential point mutation to E21R. The aim of this study is to uncover the molecular mechanism of E21R mutation in enhancing the antimicrobial activities of HD5 in serum, so as to provide deep insights into the relationship among the space structure,antimicrobial activity and the environmental influence of defensins, and lay a foundation for the exploitation of human defensins.

防御素是一种内源性阳离子多肽，因抗病原微生物作用突出和不易产生耐药而有望成为新一代抗生素，但在血清等环境中防御素的抗微生物活性显著受阻，限制了其开发应用。在前一个基金资助下，我们通过体外进化与筛选获得一株在较高浓度血清中仍具有显著抗菌和抗病毒活性的人α防御素5突变体HD5-E21R（第21位谷氨酸E突变为精氨酸R）。根据HD5的空间结构和电荷分布特点，推测血清中盐离子和相关蛋白对HD5活性影响存在"位点+电荷"效应，而E21可能是外界因素干扰HD5的一个敏感位点。为此，本项目拟采用SPR、HPLC等方法，结合位点突变和空间结构分析，从氨基酸位置、电荷数量与分布、血清蛋白封阻等方面，探讨E21R突变提高HD5抗微生物活性和逃避血清干扰的分子机制，并增加相关位点突变以进一步提高HD5抗血清干扰能力和体内应用效果。旨在深入解读防御素结构-效应-环境因素影响之间的关系，为加速其开发和应用奠定基础。

人防御素5（HD5）是由小肠Paneth细胞分泌的内源性阳离子肽，具有较强的抗病原微生物活性、低毒性等特点，可开发为新型肽类抗生素。鉴于HD5在高盐、血清等复杂环境中的作用受限，而E21R突变能够显著提高多肽的活性，本课题在前期定点氨基酸随机突变的工作基础上，阐明了E21R突变增强HD5功能的“位点+电荷”效应。课题结论如下：（1） 通过晶体可视化软件Pymol分析，研究将HD5的碳末端不同氨基酸（Thr7、Leu16、Glu21、Ser23、Gly24）分别突变为精氨酸（Arg），虚拟克隆实验发现E21R-HD5的活性明显强于其它突变肽。高浓度盐溶液和血清环境中，HD5几乎失活，而E21R-HD5可保持较好的抗微生物作用。生物膜干涉揭示，尽管与血清白蛋白之间的亲和力强于HD5（E21R-HD5，75.1 nM；HD5, 171 nM），E21R-HD5抗白蛋白干扰的能力显著增强。（2）HD5具有多齿结合能力，自身通过自缔合可以浓度依赖性地形成多聚体，放大单体肽的活性。X-射线单晶衍射解析出E21R-HD5的晶体结构，发现该突变肽为单体肽，无自缔合功能。结合盐离子的“屏蔽效应”，我们在“位点+电荷”基础上提出“合理的Arg突变可补偿防御素构象缺陷、强化多肽抗干扰能力”的观点，给予后续防御素衍生抗生素的设计重要启示。（3）在抗病原微生物机制上，研究发现E21R-HD5抗人单纯疱疹病毒能力的提高与其结合衣壳蛋白gD（E21R-HD5，2.1 nM；HD5, 5.1 nM）、抑制病毒黏附宿主细胞的作用增强相关，而抗菌活性的增加与其亲和细菌外膜负电荷成分脂质A和磷壁酸LTA、破坏细菌内外膜的作用增强相关。（4）综合结构-效应关系研究的结论，我们设计并合成了双点突变肽T7E21R-HD5。抗菌、亲和、破膜实验结果均显示，T7E21R-HD5的活性显著强于E21R-HD5。等温滴定提示，E21R-HD5在T7R突变后自缔合能力明显改善。X-射线单晶衍射证实，T7E21R-HD5为非对称二聚体，进一步拓宽了Arg突变的生物学意义。利用科学的构效研究方法，本课题详细解读了HD5及其突变肽的结构、生物学效应与环境影响因素之间的关系，为加速HD5的开发和应用奠定了坚实的基础。