基于芳樟醇生物合成的有序超分子支架构建及其自组装机理研究

Linalool, with a variety of biological activities, is the largest used fragrance in the world, with a variety of biological activity. Due to its cytotoxicity, linalool titers of recombinant strains constructed by microbial metabolic engineering is very low. To generate a linalool biosynthesis module in recombinant strains, supramolecular scaffold CfPduA* from Citrobacter freundii, artificial mini-scaffoldin (MixA3) and its corresponding complementary peptides (Dockerin) from cellulosome, the key enzymes in the linalool biosynthesis will be targeted to this intracellular filamentous arrangement. It not only isolates toxic linalool from the host cells, but also enhances metabolic flux of linalool, as well as improves the catalytic efficiency of enzymes by compartmentalization. Furthermore, the docking module will facilitate the rapid optimization of pathway flux through controlling the stoichiometry of enzymes recruited to the functional complex. As the CfPduA* nano-supramolecular scaffolds are built, the self-assembly mechanism of the CfPduA* will be elucidated. The proposed research not only develops a new linalool biosynthesis module, but also establishes a powerful modularization strategy based on the CfPduA*-MixA3 supramolecular scaffold be applied for the pathways that other toxic intermediates involved.

芳樟醇是世界用量最大的香料，具有多种生物活性，由于其细胞毒性，其微生物代谢工程改造水平低下。本项目选用弗氏柠檬酸杆菌微区蛋白CfPduA*作为超分子支架，利用纤维小体支架蛋白（MixA3）和其对接模块（Dockerin），将芳樟醇合成途径中的关键酶引入纤维状的超分子支架，构建具有芳樟醇生物合成模块的代谢工程菌，既可以提高细胞对芳樟醇的耐受性，又能够通过区室化提高芳樟醇合成的代谢通量和途径功能酶的催化效率。同时将MixA3应用于芳樟醇生物合成模块的搭建，可有效调控复合酶的数量，将促进代谢通量的快速优化。在搭建CfPduA*蛋白纳米级超分子支架的同时，将阐明CfPduA*蛋白超分子支架的自组装机制。研究不仅能够发展全新的芳樟醇生物合成模块，而且所构建的基于CfPduA*-MixA3的超分子支架的设计将为其他具有细胞毒性化学品的代谢途径提供了一种极具潜力的模块化策略。

芳樟醇和香叶醇广泛应用于农业、香精香料、医药等行业，但由于产量低、生产成本高，其应用受到限制。本项目选用来自大鼠的GTP酶结合结构域（GBD）、来自小鼠的Src 同源性3（SH3）结构域，以及来自适配器蛋白syntrophin的PSD95/DlgA/Zo-1（PDZ）结构域作为作为超分子支架，构建具有芳樟醇生物合成模块的代谢工程菌。支架蛋白GBD、SH3和PDZ的配体分别与左旋芳樟醇合成途径中关键酶连接，3种关键酶是来源于大肠杆菌的异戊烯基二磷酸异构酶（EcIDI）、来源于大冷杉的香叶酰二磷酸合成酶（AgGPPS）和来源于棒状链霉菌的芳樟醇合酶（ScLIS）。通过改变不同酶相互作用域的数量，平衡各酶的相对通量和补料分批发酵，菌株IGL114在分批补料发酵的条件下积累了1523.2 mg/L的左旋芳樟醇，比无支架对照组的左旋芳樟醇浓度提高了约10倍。由于支架蛋白GBD、SH3、PDZ和对应配体在结合力上存在较大差距，将SH3、来源于纤维小体的合成支架蛋白MixA3中的Cccohesin/Ctcohesin和其对接模块Ccdockerin/Ctdockerin应用于香叶醇生物合成模块的搭建。通过比较支架蛋白组成和配体蛋白的筛选，选用结合力相近且效果较好的SH3、Ccdockerin和Ctdockerin作为支架蛋白，也有效促进了代谢通量的提升。结果显示超分子支架系统能够通过区室化提高芳樟醇合成的代谢通量和途径功能酶的催化效率，研究不仅能够发展全新的芳樟醇等单萜生物合成模块，而且所构建的基于蛋白超分子支架的设计将为其他具有细胞毒性化学品的代谢途径提供了一种极具潜力的模块化策略。.利用通过筛选获得的融合标签变体E1*，使香叶醇合酶的表达获得提升，从而使重组菌的香叶醇摇瓶产量达到2124.1 mg/L，达到最大理论产量的27.2%。鉴于香叶醇对大肠杆菌产生严重的抑菌作用，开发了“生物衍生化-全细胞催化-树脂原位吸附分离”策略。构建了毒性较低的乙酸香叶酯重组菌G2E和具有乙酸香叶酯水解活性的重组菌E2G，G2E能产生2604.5 mg/L乙酸香叶酯醇。E2G能在8 h内将20 g/L底物乙酸香叶酯几乎全部水解（98.6%），水解速率为1.2 g/L/h。最后将含有产物的有机相直接通入商品化树脂XAD4的吸附柱，香叶醇产量达到13.19 g/L，纯度为99.9%。