基于纤维小体脚手架蛋白的多酶共展示体系构建及其催化制备DHA的研究

Consolidated bioprocessing (CBP) represents a promising technology for biofuel and chemicals production. The construction of an engineered strain codisplaying multi-enzyme with man-made miniscaffoldins is the forefront of research. In this research project, the construction of a multifunctional Pichia pastorios whole-cell catalyst displaying three different enzymes and its application in the conversion of woody plant oils to 1,3-dihydroxyacetone (DHA) and fatty acid methylesters (FAME) are investigated. The multi-enzyme system consists of a miniscaffoldin containing three cohesin modules, which are tethered to the cell surface through the yeast anchor adhesion receptor,including lipase, glycerol dehydrogenase and cytochrome P450BM3, each bearing a C-terminal dockerin. The trifunctional multi-enzyme catalysis system will give yeast cells the ability to simultaneously transfer woody-plant oils into FAME and DHA. The new multi-enzyme codisplay scaffolds and new NADH coenzyme regeneration system represent a useful engineering platform for developing CBP-enabling mocroorganisms on the basis of elucidating principles of multi-enzyme systems construction and mode of action.Woody-plant oils are important non-edible forest resourses and DHA is important intermediates of chemicals and pharmacy. The preparation of DHA from woody plant oils using the constructed whole-cells as catalyst can increase the add-value of products and effectively improve the utilization of forest resources. Therefore, this research has important theoretical and practical value.

采用统和生物技术（CBP）研究可再生资源生物催化制备能源和化学品极具潜力，其中利用纤维小体脚手架蛋白构建复合酶共展示体系是研究前沿。本项目利用适宜的纤维小体脚手架蛋白和锚定蛋白融合，以性能优异并能协同作用的脂肪酶、甘油脱氢酶和细胞色素P450BM3酶通过自身携带的对接模块和脚手架蛋白上的粘连模块特异性结合，将3种酶定量有序的展示在酵母细胞表面，并将获得的全细胞催化剂催化木本油脂一步法制备生成脂肪酸甲酯（FAME）和1,3-二羟基丙酮（DHA）。在阐明共展示体系构效关系的基础上，构建的全新多酶共展示骨架和全新NADH辅酶再生系统有望应用于其它CBP微生物。木本油脂是可再生的非食用林业资源，而DHA是重要的化工医药中间体及药物，利用非食用木本油脂为原料，以构建的全细胞催化剂制备DHA有着重要的潜在利用价值，可有效提高林业资源的利用。本研究具有重要的科学理论意义和实际应用价值。

对Candida boidinii甲酸脱氢酶（CbFDH）基因进行密码子优化，融合酶CbFDH-Ccdockerin在大肠杆菌中实现了可溶性表达。选取细胞色素P450还原酶的晶体结构4dql_A为结构参考模型，通过SWISS-MODEL Workspace在线分析，确定辅酶特异性相关的关键氨基酸残基，通过定点突变获得巨大芽孢杆菌P450单加氧酶（CYP102A1）的三突变体P450tri（R966L/K972L/W1046H），显著提高了酶对NADH的利用效率，可能原因为突变体通过破坏空腔与NADPH分子中磷酸基团之间的极性相互作用，以及减弱电子传递空间位阻，改善CYP102A1对NADH的利用效率。.系统分析Clostridium thermocellum，C. cellulolyticum以及Ruminococcus flavefaciens脚手架蛋白黏结模块（cohesin）的DNA序列，通过拼接构建MixA3。经分析显示，cohesin结构域均含有50%左右的疏水氨基酸，形成一个疏水性内核， dockerin模块均含有两个重复片段，这两个重复片段像“夹子”一样识别cohesin结构域表面的结合位点，从而实现cohesin::dockerin之间的相互作用，利用pull-down方法验证了cohesin::dockerin之间的相互作用。以酿酒酵母细胞壁蛋白Sed1p为锚定蛋白，将MixA3锚定于毕赤酵母细胞表面，然后通过cohesin结构域与dockerin模块之间的相互作用，将CbFDH和CYP102A1共展示于毕赤酵母细胞表面，构建基于纤维小体脚手架蛋白多酶共展示体系，该共展示体系可实现NAD+-NADH辅酶系统的循环再生。.将南极嗜冷脂肪酶（LIP7195）和大肠杆菌甘油脱氢酶（EcogldA）分别在大肠杆菌中进行可溶性表达优化。选择LIP7195、南极假丝酵母脂肪酶（CALB）和EcogldA构建协同催化体系制备1,3-二羟基丙酮（DHA）。最佳反应条件为，反应温度40 oC，pH值为9.0，最适酶配比CALB：LIP7195：EcogldA=28：7：15，总酶量为81 U/g底物，反应6 h，三丁酸甘油酯为底物，DHA的最大得率为48.7%，而以玉米油和大豆油为底物，DHA得率分别为32.3%和35.6%。