立体选择性舞毒蛾烯烃单加氧酶的定向进化及催化机理研究

舞毒蛾性信息素的生物合成路径已被查明，生物转化法是合成舞毒蛾性信息素的有效途径，而制备适合舞毒蛾性信息素合成的立体选择性烯烃单加氧酶是实现该途径的关键步骤。本项目将研究来源于雌舞毒蛾性腺的烯烃单加氧酶，首先通过简并引物设计，克隆出该酶的基因；然后实现其在酵母中表达，并利用YEASTMAKER转化系统构建突变文库，对该酶基因进行定向进化；选出具有优质特性的突变株，分析不同突变基因序列及结构和功能之间的关系，阐明该酶的手性环氧化的催化机理，为提高舞毒蛾性信息素产量的生物代谢途径工程获得理论依据。本项目是在首次具有应用针对性地开展单加氧酶的研究，具有研究特色和创新性。

舞毒蛾性信息素的生物合成路径已经被查明，生物转化法是合成舞毒蛾性信息素的有效途径，而制备适合舞毒蛾性信息素合成的立体选择性单加氧酶是实现该途径的关键步骤。本项目研究了来源于巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）ALA2的细胞色素P450BM-3A蛋白，该蛋白是由1个单加氧酶P450区域和2个二黄素还原酶(FMN和FAD) 区域和一个NADPH氧化还原酶结合域组成的，无需还原辅酶即可进行环氧化催化，活性比哺乳动物或植物细胞中的活性高得多，对于实现舞毒蛾性信息素的生物合成更具现实性。完成了对来源于巨大芽孢杆菌ALA2的胞色素P450BM-3A蛋白基因的克隆和表达，经过不同的大肠杆菌系统的表达对比，发现以trc启动子的质粒作为载体，表达的重组细胞色素P450BM-3A酶活较高。经过Ni-NTA的纯化和定性，重组酶的最适温度为40oC，最适pH为8.0。P450BM3A酶对温度和pH敏感，40oC保温1 h，酶活降低了50%；pH 8.0时保持0.5 h的残留酶活为50%。纯化重组P450BM3A酶对多种底物有催化作用，其中对不饱和脂肪酸亚油酸的催化活性最高达到3058 U/mg，对软脂酸的催化活性最高达到2095 U/mg，对舞毒蛾性信息素的前体不饱和烯烃2-甲基-7-十八烷烯的催化活性为55 U/mg。以2-甲基-7-十八烷烯为反应底物，细胞色素P450BM3A酶作为反应的催化剂，NADPH为辅助因子，反应后用正己烷萃取，得到的产物用气相色谱进行分析，发现产物为7，8-环氧-2-甲基十八烷（即为舞毒蛾性信息素），这为生物合成舞毒蛾性信息素提供了一种可能。. 利用SWISS-MODEL Workspace对细胞色素P450BM3A酶催化域在线建模，通过定点随机突变，成功获得突变酶F394V、T269R、T269S。以软脂酸为底物，突变酶T269R、T269S的酶活分别为2765 U/mg和2703 U/mg，较原始酶提高30%左右。推测突变后269位丝氨酸（S）空间位阻更小，精氨酸（R）为碱性氨基酸，更适合于底物软脂酸结合。该结果为提高舞毒蛾性信息素产量的生物代谢途径工程获得了一定的理论依据。