茶树J蛋白CsDJC24调控芳樟醇合成酶活性的机制研究

Linalool is curial for tea aroma quality due to its pleasant scent and high odor activity. Linalool, which presents in processed tea, mainly comes from biosynthesized and stroed linaool in fresh tea leaves. Characteristic analysis of linalool synthase gene CsLIS/NES was done previously by our group, but the mechanisms that how the activity of CsLIS/NES was regulated remains unkonwn. According to the literatures and previous pull down analyses, CsLIS/NES was supposed to be regualted by a J protein CsDJC24. Through the correlation analyses of CsDJC24 content and CsLIS/NES activity and linalool content at different development stages, organs and stresses, the correlation coefficiences between CsDJC24, CsLIS/NES and linalool could be uncovered. Through transient over-expression of CsDJC24 in N. benthamiana and complemention experiment in Arabidopsis djc24 mutant, we would able to find out effects of CsDJC24 on linalool synthase activity and linalool biosynthesis. Through the physical interactions analyses between CsDJC24 and Hsp70 and between CsDJC24 and CsLIS/NES, we would able to uncover the mechanisms of posttranscriptional regulations of CsDJC24 on CsLIS/NES activity. This proposed study will push our insight further on linalool biosynthesis, and set theoretical basis for CsDJC24 as a biochemical label in high aroma quality tea breeding.

芳樟醇香气好、活性高，是茶叶最重要的香气物质之一，成茶中芳樟醇主要来源于茶鲜叶中生物合成并储存的芳樟醇。申请人此前发现茶树芳樟醇合成酶基因CsLIS/NES在茶树中负责芳樟醇的生物合成，然而其活性调控机制未见报道。通过文献阅读和pull down实验，申请人推测J蛋白CsDJC24可调控CsLIS/NES的酶活与芳樟醇生物合成。拟在不同组织和逆境下，研究CsDJC24含量与CsLIS/NES活性和芳樟醇含量的相关性；通过在本氏烟过表达CsDJC24及在拟南芥突变体中互补表达CsDJC24，确定CsDJC24对CsLIS/NES活性和芳樟醇生物合成的影响；通过研究CsDJC24、Hsp70和CsLIS/NES的互作关系，确定CsDJC24调控CsLIS/NES活性的机制。本研究将加深对CsLIS/NES活性调控和芳樟醇生物合成的认识，并为高香茶树良种选育提供新的生化标签。

芳樟醇香气好、活性高，是茶叶最重要的香气物质之一，成茶中芳樟醇主要来源于茶鲜叶中生物合成并储存的芳樟醇。本课题组此前证实茶树芳樟醇合成酶基因CsLIS/NES在茶树中负责芳樟醇的生物合成，然而其活性调控机制未见报道。通过文献阅读和pull down实验，推测J蛋白CsDJC24可调控CsLIS/NES的酶活与芳樟醇生物合成。通过使用大小叶种的cDNA模板进行DJC24克隆和DJC24在大小叶种和4种茶属植物中的转录水平研究，证实DJC24在大小叶种均有存在，且转录水平无明显差异，表明DJC24表达量可能不是决定芳樟醇在大小叶种中生物合成茶芽的关键，其蛋白功能或许更为重要。而DJC24与LIS/NES双荧光素酶互补实验却证实二者无活体互作，表明CsDJC24无法直接调控CsLIS/NES活性。为探明CsDJC24可能的作用机制，本课题组随后以CsDJC24和茶芽蛋白组进行酵母双杂实验，结果显示CsDJC24与DXS存在离体互作。此前已有报道证实拟南芥中J20与DXS存在互作。DJC24与J20同属I型J蛋白，二者结构非常相似，则DJC24与DXS活体互作可能性极大，则CsDJC24可通过间接方式来调节CsLIS/NES活性以及树芳樟醇生物合成。但仍需后续研究证实。且DJC24与J20在与共同DXS互作时关系如何，即竞争抑制还是合同增效，为我们理解J蛋白作用机制以及加深叶绿体中蛋白活性调节的认知亦具有重要意义。此外，本课题组发现茶树酪蛋白复合酶体亚基ClpP3存在一个可变剪接亚型ClpP3m，通过正向遗传学实验，发现ClpP3m参与了郁金香黄化茶的黄化机制形成。通过电导率检测绿茶和白茶加工过程中的细胞损伤变化、p-NPG法检测内源酶活的变化、UPLC-Q-tof-MS/MS检测糖苷含量变化等，发现绿茶加工过程中糖苷大量降解，为我们理解茶叶加工过程中糖苷变化及糖苷在成品茶中的香气贡献提供了理论基础。