类风湿性关节炎全基因组甲基化调控网络及功能机制研究

Rheumatoid arthritis (RA) is a complex human autoimmune disease determined by genetic and environmental factors, but the specific genetic/epigenetic factors are unknown. Epigenetics studies (e.g., DNA methylation) have become research frontier of genetics researches on complex diseases. DNA methylation is an important reprehensive epigenetics research. Previous studies only investigated the overall level of methylation or methylation level of very small amounts of candidate genes. Thus, it is difficult to comprehensively and in-depth explore RA related epigenetic control factors. In this project, we will adopt a case- control study design, using the efficient and economic genome-wide methylation chip detection technology to detect the RA-associated methylation sites and the network. Then, based on the existing mRNA expression of the same subjects, we will build an regulation network of DNA methylation and mRNA. We will also validate several selected DNA methylation sites in another independent sample. Some molecular and cellular experiments (e.g., do the methylation sits have effects on the activation, proliferation and cell cycle of T lymphocytes?) will be performed to detect the functional mechanism underlying the association between methylation and RA. The project will detect the comprehensive methylation site and their interaction networks. The results will provide scientific basis for studies on new strategy of clinical diagnosis and treatment in RA with the breakthrough point of DNA methylation.

类风湿性关节炎（RA）是遗传因素和环境因素共同导致的复杂疾病，但是大多数遗传/表观遗传因子未明。以DNA甲基化为代表的表观遗传学研究是复杂疾病遗传学研究前沿领域，但既往RA相关的DNA甲基化研究多局限于总体甲基化水平或极少量候选基因的甲基化水平上，难以全面、深入发掘RA相关的表观遗传控制因素。本项目将采用病例-对照研究设计，运用高效、经济的全基因组甲基化芯片检测技术鉴定RA相关的差异甲基化位点，建立与RA的关联网络，并结合该人群的mRNA表达谱建立DNA甲基化与mRNA的调控网络。在独立样本中验证显著差异甲基化位点，再通过T淋巴细胞活化、增殖和细胞周期等细胞分子实验揭示甲基化位点与RA相关的功能机制。本项目可能系统地鉴定RA相关的甲基化位点及作用网络，为研究以DNA甲基化为切入点的临床诊疗新策略提供科学依据。

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）的病因机制未明。本研究从表观遗传学的视角探索DNA甲基化在RA中的作用机制。本研究第一阶段应用450K 甲基化芯片系统分析25名RA病人和18名健康对照的外周血单个核细胞全基因组甲基化水平，筛选出1046个RA特异的差异甲基化位点并结合该人群的全基因组表达谱数据进行关联分析，再运用生物信息分析技术（包括STRING、Cytoscape、三步过滤法因果推断）构建差异甲基化基因的调控网络，发现以MX1、IFI44L、DTX3L、PARP9为关键差异甲基化基因的干扰素诱导基因相互作用网络与RA有关。第二阶段，选择10个RA相关的差异甲基化基因，应用methyltargetTM技术在独立样本（RA:Control=25：27）中验证目标区域特定位点的差异甲基化，应用RT-PCR技术在独立样本（RA:Control=35：35）中验证基因的差异表达情况。结果显示BLK、MX1、PARP9基因特定位点的差异甲基化得到了验证，BLK、IFI44L、MX1、PARP9基因的差异表达得到验证。第三阶段，首先验证了5-氮杂胞苷处理前后Jurkat细胞PARP9基因三个特定位点中有两个位点（POS.105/MAPINFO122281940和POS.163/MAPINFO122281882）的甲基化水平与基因表达呈显著负相关；其次，构建PARP9基因过表达和慢病毒干扰的Jurkat稳定表达Jurkat细胞株，功能试验发现PARP9过表达使Jurkat细胞的增殖速度加快，细胞周期分布呈现在G0/G1期和S期细胞数量偏少，而G2/M期细胞数量增多的现象，而PARP9低表达则降低细胞增殖速度，细胞周期分布则表现为G0/G1期细胞数量偏多、S期和G2/M期细胞数量偏少（P＜0.05）； RA相关细胞因子IL-2的表达受PARP9基因表达的正调控，而IL-4和IFNγ的表达受PARP9基因表达的负调控，PARP9的低表达会显著降低IL-1β和IL-6的表达。因此，PARP9基因特定位点的异常甲基化可能通过影响基因表达，进而影响T细胞增殖及调控相关细胞因子的表达对RA产生致病作用。本研究将为全面了解RA全基因组甲基化模式对基因表达的影响提供基础数据，为RA的病因研究及防治提供新线索，为研究以DNA甲基化为切入点的临床诊疗新策略提供科学依据。