自噬在抗肿瘤药物苏尼替尼诱导的心脏毒性中的作用研究

苏尼替尼是一种口服小分子多靶点的酪氨酸激酶受体抑制剂，临床上主要用来治疗肾细胞恶性肿瘤与肠胃道基质瘤。临床观察发现，苏尼替尼可能引起充血性心力衰竭和左心室功能紊乱，但其心脏毒性的发生机制目前并不清楚。我们的前期实验已证实苏尼替尼对体内外心肌细胞呈现一定的毒性，并发现这种作用可能是通过引起心肌细胞的自噬造成的。本项目将通过对苏尼替尼引起体内外心脏毒性的观察，采用吖啶橙染色、细胞转染、电镜等技术观察其诱导心肌细胞自噬的形态学改变，以及PI3K通路与mTOR通路对其诱导自噬的调控作用研究，旨在阐明苏尼替尼诱发心脏毒性的分子机制。在此基础上，进一步研究自噬抑制剂能否逆转苏尼替尼诱发的心脏毒性，为苏尼替尼诱发心脏毒性的预防或治疗提供可能的策略。这些研究不仅有利于发现苏尼替尼对心脏的毒性作用特点及机制，丰富抗肿瘤药物特别是靶点特异性新型抗肿瘤药物诱发心脏毒性的基础理论，还可为防治这类毒性提供思路。

一．研究目的：.探讨苏尼替尼引起的大鼠H9c2心肌细胞毒性作用，并探索二氢杨梅素对苏尼替尼引起的心肌细胞毒性的保护作用机制。.二．研究结果：.1．苏尼替尼引起的大鼠H9c2心肌细胞毒性作用与细胞自噬有密切的关系：（1）苏尼替尼对大鼠H9c2心肌细胞表现出较强的体外毒性作用，作用48 h 后计算半数抑制浓度IC50值为6.53 μM；（2）DAPI染色发现，随着给药浓度的升高，H9c2细胞的死亡率随之升高，但凋亡现象不明显；（3）AO染色发现， H9c2细胞内酸性自噬泡生成明显增加；（4）转染GFP-LC3质粒发现， H9c2细胞内自噬泡生成明显增加；（5）Western-blot结果显示， H9c2细胞内凋亡蛋白的表达没有明显的变化，但是细胞内自噬蛋白LC3、Beclin-1的表达与苏尼替尼存在明显的浓度依赖性和时间依赖性关系；（6）siRNA法沉默Beclin-1后，抑制细胞自噬的水平，与对照组相比细胞存活率明显增加。.2．二氢杨梅素对苏尼替尼引起的大鼠H9c2心肌细胞毒性具有比较明显的体外保护作用：(1) 二氢杨梅素对苏尼替尼引起的H9c2细胞的抑制作用表现出明显保护作用，作用24 h 后苏尼替尼5 μM单用组和50 μM二氢杨梅素预处理组细胞抑制率分别为28.3%、3.1%；(2) ROS检测结果显示，苏尼替尼作用3 h 后，H9c2细胞内活性氧生成明显增加，呈现出明显的浓度依赖性关系；合用后与苏尼替尼单用组相比ROS生成显著降低；（3）AO染色发现，合用后苏尼替尼引起的H9c2细胞内酸性自噬泡的生成明显减少；（4）Western-blot结果显示，二氢杨梅素可以通过抑制JNK激活来抑制苏尼替尼引起的Beclin1上调，从而抑制自噬的激活。.三．结论：.（1）苏尼替尼引起的大鼠H9c2心肌细胞毒性作用与细胞自噬有密切的关系。.（2）二氢杨梅素能显著抑制苏尼替尼引起的细胞自噬，减少其心肌细胞毒性作用。