基于临床定量激酶组学研究发现肝癌早期诊断标志物

The detection and diagnosis of hepatocellular carcinoma (HCC) at an early stage is critical for long-term patient survival. However, no high effective biomarker can be used in HCC early diagnosis nowadays. It is necessary to discover optimal clinical performance diagnostic biomarker based on pathogenesis mechanism. Protein kinases, which involved in signaling pathway related to cancer growth, invasion, and metastasis, are key regulators in HCC development and progression. Protein kinase inhibitor (Sorafinib) has been used as first-line treatment for advanced HCC. In this proposal, we will perform quantitative kinomic and phosphokinomic study on clinical samples (normal liver, cirrhosism, HCC and precancerous tissue) using multiple protein kinase inhibitors enrichment combined with mass spectrometry analysis. This large-scale, unbiased, kinase-targeted approach will help us to find HCC early diagnostic biomarker candidate. Furthermore, immunohistochemistry and western blot analysis will be performed to validate our kinomic and phosphokinomic results from large number clinical sample. Then, functional analysis of the selected key kinases will be investigated at animal model. Our goal is to provide a set of HCC diagnostic kinase biomarker with high selectivity and sensitivity, which will be used in clinical screening in the future. In addition, this study will provide some anticancer drug target and help to discover new HCC treatment drug.

肝癌早期诊断是其有效治疗与长期生存的关键，从疾病发生发展机制层面，溯源式探寻高灵敏、高特异且具有临床通用价值的早期诊断标志物是其解决之道。蛋白激酶功能失调是导致癌症产生的关键因素，其介导的多个信号通路与肝癌发生发展密切相关，涉及细胞增生、血管生成、侵袭和生存。蛋白激酶抑制剂也已成为目前肝癌分子靶向治疗一线用药。为此，本项目拟从定量激酶组视角切入，关注肝癌形成进程中激酶组及磷酸化激酶组动态变化，采用多种小分子抑制剂富集激酶结合质谱分析的化学蛋白质组技术，对临床标本（含正常肝、肝硬化、早期肝癌及癌旁组织）激酶组及磷酸化激酶组进行非定向、全景式定量表征，遴选肝癌早期诊断候选标志物；进一步运用免疫组化方法开展大样本临床确证及动物水平的标志物生物学功能实验，以期为临床提供灵敏度高、特异性强且生物学功能与机制明确的肝癌早期诊断新分子标志物，亦可为激酶靶向抑制剂的研制提供研究基础。

肝癌是世界范围内常见恶性肿瘤，在我国居癌症死因第二位，生存期短、死亡率高是其典型特征。原发性肝癌起病隐袭，早期病症不明显导致诊断难度大，确诊时大部分患者已癌症晚期或局部转移。对于晚期肝癌，目前唯一的靶向药物为多激酶抑制剂索拉菲尼，且仅对20~30%病人有效。因此，高灵敏早期诊断标志物和靶向药物新靶点的发现是肝癌研究领域亟待解决的难题。蛋白激酶功能失调是导致癌症产生的关键因素。激酶介导的多个信号通路与肝癌的发生发展密切相关。对整个信号通路网络的激酶组变化研究有助于揭示肝癌的复杂发病机制，寻找灵敏、特异性高的肝癌早期诊断标志物以及新的治疗靶点。.本项目建立了小分子抑制剂富集激酶结合非标记定量蛋白质组技术的激酶组研究新方法，能够对激酶组进行非定向、全景式定量表征，大大提高了定量激酶组研究的准确性和可靠性。应用该方法对来自临床的肝癌及癌旁组织进行了激酶组学比较研究，共找到93种差异显著的激酶，其中80个激酶在肝癌组织中表达量上调，13个激酶在肝癌组织中表达量下调。这些激酶在人类激酶组的9类中均有分布。对11种差异激酶进行了western blot验证，结果与质谱定量结果一致，证明了质谱定量的可靠性。通路分析表明，差异激酶涉及多个信号通路，包括MAPK、PI3K/AKT/mTOR、VEGF、Wnt、Hedgehog信号通路、磷脂酰肌醇信号系统及细胞周期。这些通路之间相互作用，形成一个复杂网路，显示了肝癌发病机制的复杂性。其中VEGFR-2、CDK6和mTOR等24个关键激酶参与了这些重要信号通路的调节。生存相关分析表明18种差异激酶与生存密切相关，包括肝癌晚期治疗药物索拉菲尼的重要靶点VEGFR及MAPK通路的重要激酶Erk1。综上所述，本研究建立了激酶组研究新方法，具有广泛的应用价值。通过对肝癌激酶组的比较研究，揭示了肝癌发生发展过程中由激酶介导的信号通路网络的复杂性，为肝癌发病机制及治疗研究提供线索。找到了93种差异激酶，它们是肝癌早期诊断标志物的候选靶标和新药研究的候选靶点，具有潜在的临床应用价值和较高的学术价值。.