细胞质雄性不育辣椒花粉程序性细胞死亡机制的研究

The cytoplasmic male sterile (CMS) line 8214A is very important in the utilization of heterosis in pepper. However, the mechanism of its male sterile is not clear. The results of our early period study showed that the microspore mother cells (MMCs) in the cytoplasmic male sterile line 8214A appeared typical PCD sign such as nuclear extrusion, nuclear coagglutnation and pyknosis, cytoplasm contraction, mitochondrial vocuolization and so on，after entering the meiotic division. The meiotic division formed abnormal tetrad and then pollen aboration. Therefore, the meiotic division of microspore mother cells was the crucial period of pollen aboration in 8214A. To elucidate the molecular and cytologic mechanism of abnormal PCD of MMCs in cytoplasmic male sterile pepper, this project will be studied from the difference of the structure and the expression of related mitochondrial genes in the abnormal PCD of MMCs and their relations with the change of ultrstructure, ATP, Ca ion and cytoskeleton of MMCs by modern molecular amd cytologic technology, and the CMS line 8214A and the corresponding maintainer line 8214B in pepper as experimental material. And then to reveal the related mechansim of the abnormal PCD of MMCs and pollen aboration in the CMS pepper.

我们的前期工作发现辣椒细胞质雄性不育系8214A花粉败育明显不同于禾本科植物的雄性不育类型：不育系小孢子母细胞在进入减数分裂时开始出现核穿壁、细胞核凝集固缩、细胞质收缩、线粒体空泡化等典型PCD迹象，减数分裂不能正常进行和形成异常四分体，花粉以PCD方式在四分体时期完全败育，花粉母细胞减数分裂期是花粉败育的关键时期。在此基础上，本项目以辣椒细胞质雄性不育系8214A及其保持系8214B为试验材料，运用现代分子与细胞生物学研究技术，通过线粒体深度测序技术（Illumina HiSeq 2000），结合透射电镜技术和免疫荧光技术，系统分析不育系小孢子母细胞线粒体特异基因结构与表达信息、及其与小孢子母细胞超微结构、ATP能量水平、Ca2+信使系统、细胞骨架变化的关系，阐明细胞质雄性不育辣椒小孢子母细胞异常PCD的分子与细胞学机制，从而揭示花粉败育的相关机理。

细胞质雄性不育(CMS)是一种质核互作抑制有效花粉产生的遗传性状, 在农作物杂种优势利用上具有重要作用。辣椒是一种杂种优势非常明显的作物，用细胞质雄性不育系为母本生产杂交种子是其杂种优势利用的重要途径。辣椒细胞质雄性不育系8214A具有100%不育率和优良的综合经济性状，是理想的亲本材料，已被成功用于辣椒杂交制种。但是其雄性不育机理尚不清楚。我们的前期工作发现，辣椒细胞质雄性不育系8214A花粉败育的关键时期是花粉母细胞减数分裂期，其花粉以PCD方式在减数分裂结束后完全败育。在此基础上，本研究拟以辣椒细胞质雄性不育系8214A及其保持系8214B为试验材料，对不育系花粉败育进行了系统的细胞学研究：⒈电镜技术表明，不育系花粉母细胞最早异常是在减数分裂Ⅰ前期出现“染色质穿壁”，随后药囊内的花粉母细胞减数分裂不同步，甚至部分花粉母细胞提前退化，且呈现出典型的PCD细胞学特征，减数分裂结束后花粉全部退化降解；⒉ TUNEL检测技术发现，不育系中减数分裂早期部分花粉母细胞以及减数分裂结束后的花粉中呈现出DNA断裂的阳性反应；⒊ 微管细胞骨架的免疫定位表明，不育系花粉母细胞减数分裂过程中出现异常的纺锤体、二分体和四分体；⒋ Ca 离子和ATP酶的超微细胞化学定位表明，不育系减数分裂过程中绒毡层和花粉母细胞中分布的Ca 离子和ATP酶明显低于可育花药。 与此同时，利用Illumina HiSeq 2000平台对不育系和保持系花药减数分裂过程中的基因表达进行RNA-seq分析，共获得1355个差异表达基因，且不育系中显著上调基因有424个和显著下调基因931个。差异表达基因的GO富集分析显示，不育系中泛素化连接酶基因和细胞周期停滞与负调控有关基因明显受抑制，甲级转移酶基因的活性被激活，这些基因参与DNA损伤修复与细胞死亡和调控细胞周期，与细胞学方面的研究结果相吻合，从而被认为是与花粉PCD相关基因。