辣椒细胞质雄性不育恢复基因的图位克隆及功能解析

In this study, the pepper F2 progeny of the cross of cytoplasmic male sterile (CMS) line 'Bei A3' and the corresponding restorer line 'B072', together with their parental lines are to be used for the map-based cloning of pepper restorer of fertility (Rf) gene. Based on the accomplishment of pepper whole genome squencing, re-sequencing of 'Bei A3' and 'B072', an ultra high density genetic map comprised of 7566 single nucleotide polymophism (SNP) markers and the preliminary mapping of the Rf gene into 400kb region, we then intend to clone the candidate. By analysis of its expression on transcription and translation level and by using agrobacterium-mediated transformation, finally comfirm the Rf gene function. Then we are going to identify the protein interacted with pepper Rf gene through the yeast two-hybrid and bimolecular fluorescence complementation (BiFC) technology. This study is designed with the purpose of cloning Rf gene and investigating the gene acting mechanism. It would accelerate the process of breeding restorer line in practice and provide important basis for exploring molecular mechanism of fertility restoration.

本项目以辣椒细胞质雄性不育系'北A3'、相应恢复系'B072'及其F2代群体为材料，在完成辣椒全基因组测序、完成 '北A3'和 'B072'重测序、完成基于F2代育性分离群体构建的包含7566个SNP标记的超高密度分子遗传图谱，以及将辣椒细胞质雄性不育恢复基因定位于400kb区域的基础上，试图结合经典图位克隆思路，首先克隆辣椒细胞质雄性不育育性恢复候选基因。通过研究候选基因在转录、翻译水平的表达模式，以及转基因验证，确定获得恢复基因，然后利用酵母双杂和双分子荧光互补（BiFC）等技术筛选与恢复基因互作的蛋白。本项目研究的目的是分离克隆辣椒细胞质雄性不育恢复基因并探讨其分子作用机理。本研究将为辣椒在选育种实践中高效率地选育细胞质雄性不育恢复系，在理论上探明辣椒细胞质雄性不育育性恢复的分子机理提供重要依据。

“三系”配套繁制F1代种子是杂种优势利用的有效途径。克隆辣椒细胞质雄性不育（CMS）恢复基因以及阐明其分子作用机理可以促进辣椒杂种优势更好的利用。本研究利用参与完成的辣椒全基因组（重）测序数据，通过开发覆盖辣椒全基因组的SNP、SSR和InDel标记，以辣椒细胞质雄性不育系‘BA3’、相应恢复系‘B072’及其F2代群体等为材料，构建了3张辣椒高密度分子遗传图谱，结合F2代群体的表型，将辣椒CMS恢复基因初定位于SNP标记scaffold2228.43623和scaffold874.1802868（两者物理间距约为1.81 Mb）之间。再利用‘BA3’בB702’F2大群体（n=2,520株）和F2:3群体（n=1,450），结合100 bp窗口的微共线性比较分析，最终将辣椒CMS恢复基因精细定位于CMRP42B1和CSSHjm9_60（两者物理间距约为0.31 Mb）之间，预测其中的蛋白编码基因有8个。通过对8个候选基因进行蛋白序列比对、亚细胞定位和表达分析，基本明确并克隆了辣椒CMS恢复基因的重要候选基因Capana06g003028。通过构建该基因的CRISPR-Cas9编辑载体以及遗传转化，目前正在对转基因植株及其后代的育性表型等进行调查和分析，同时，利用酵母双杂和双分子荧光互补（BiFC）等技术筛选与恢复基因互作的蛋白，以解明辣椒CMS恢复基因的分子作用机理。通过开展该项目的研究，培养毕业了1名博士研究生和4名硕士研究生，发表了7篇科研论文，其研究结果将为辣椒在选育种实践中高效率地选育CMS恢复系，在理论上阐明辣椒CMS育性恢复的分子机理具有重要意义。