雄性不育枸杞绒毡层异常程序性死亡机制

在正常花粉发育过程中，绒毡层细胞以精确的时间和空间顺序经历了PCD过程。如果绒毡层PCD异常，可导致花粉败育。所以，绒毡层对花粉发育具有重要的调控作用。对绒毡层异常PCD的研究，不仅能阐明绒毡层PCD现象的本质，而且还能揭示花粉败育的机理，同时在育种工作中具有重要的理论与实际利用价值。因此，本项目以可育和雄性不育枸杞绒毡层细胞为研究对象，运用分子与细胞生物学研究技术，开展绒毡层异常PCD机制的研究。通过cDNA-AFLP、蛋白质体内翻译和串联质谱技术，结合透射电镜技术，分析、阐明不育系绒毡层异常PCD的基因、蛋白质及其与绒毡层细胞超微结构变化、ATP能量供应、Ca2+信使系统变化的关系，最终揭示雄性不育枸杞绒毡层异常PCD的分子与细胞学机制。

研究证明线粒体异常是引发植物雄性不育的重要因素，而枸杞绒毡层异常PCD现象是导致宁夏枸杞雄性不育的原因。因此，本项目以正常可育和雄性不育枸杞绒毡层为研究对象，运用分子与细胞生物学研究技术，对分离纯化的可育系与不育系绒毡层线粒体基因、线粒体蛋白以及线粒体超微结构、绒毡层ATP酶、钙离子代谢变化进行研究，以揭示绒毡层异常PCD的细胞与分子生物学机制。研究结果显示，通过cDNA-AFLP技术比较可育系与不育系绒毡层线粒体cDNA发现，二者差异基因片段均小于50bp；而经过DNA-AFLP技术则显示线粒体DNA差异幅度范围较大，在有意义范围内（50-1000bp之间）共分离得到明显差异表达片段（TDFs）76条。对其回收、克隆、PCR验证后，获得了17条TDFs。目前已经完成了17条TDFs的测序。通过iTRAQ多肽体外标记技术与串联质谱技术，获得了绒毡层异常PCD前后可育与不育系线粒体蛋白，共鉴定到有定量信息的蛋白质420个，通过显著性分析，符合显著性指数的有119个线粒体蛋白。与可育系相比，四分体早期不育系线粒体蛋白有193个上调，216个下调，9个不变； PCD开始异常时，不育系线粒体蛋白有198个上调，111个下调，8个不变；其中上调显著的蛋白有钙网蛋白、ATP合酶（β亚基）、热激蛋白、苹果酸脱氢酶、核糖体蛋白等等。而绒毡层细胞异常PCD过程中，细胞核、线粒体、内质网、核糖体、液泡系等超微结构也呈现出了明显的异常变化。这些变化以及绒毡层细胞中的ATP酶、Ca2+离子代谢变化均与基因和蛋白质的异常变化呈现出高度一致性。初步分析表明，雄性不育枸杞绒毡层异常PCD现象是在绒毡层线粒体突变基因调控下的、相关蛋白质网络联动作用的结果，最后在细胞水平上表现出的细胞代谢与形态结构上的改变。项目详细研究结果将在近期对所有数据进行详细分析、总结、归纳后撰写论文陆续发表。