异丁醇基因工程菌种构建及其高效利用的基础研究

本申请将以构建枯草芽孢杆菌基因工程菌利用非粮原料木薯高效发酵生产生物异丁醇为研究目标，开展以下三个方面科学问题的基础研究：针对提高菌种发酵水平，分析枯草芽孢杆菌的代谢网络和转录调控网络，研究影响发酵生产异丁醇的关键代谢途径，通过基因敲除、基因过量表达等手段构建高产基因工程菌，得率达到0.38g异丁醇/g葡萄糖；针对异丁醇生产过程，优化培养基的成分配比和操作条件参数，研究木薯连续预处理、连续发酵工艺和异丁醇的膜分离高效节能分离技术，提高异丁醇的发酵生产效率、降低异丁醇的单位分离能耗，得到符合工业异丁醇质量标准的合格产品（HG/T3270-2002）；针对反应器水平发酵过程，构建全流场三维瞬态计算流体力学理论模型，揭示多相复杂生物反应体系质量传递与生物转化规律，实现异丁醇发酵过程定量化模拟与直接放大，最终形成木薯发酵生产生物异丁醇基因工程菌种构建及其高效利用的科学理论体系。

基于合成生物学，构建枯草芽孢杆菌异丁醇合成菌株，围绕“建立模型—预测靶点—实验验证”的系统代谢工程改造策略，建立了枯草芽孢杆菌异丁醇合成菌株基因组尺度代谢网络模型指导菌株理性代谢工程改造方法，提高了该菌株的异丁醇生物合成能力。为了获得稳定的枯草芽孢杆菌异丁醇合成菌株，本项目构建了异源Ehrlich 途径，并整合到宿主染色体上。微氧条件下（240rpm，37℃，密封瓶口），重组菌株的摇瓶产量达到0.93g/L异丁醇；通过引入异源α-酮异戊酸合成途径，在初始浓度为20 g/L 葡萄糖浓度下，18 小时一次性补加至20 g/L 葡萄糖，异丁醇的发酵单位为2.62g/L。为了有效提高菌株合成异丁醇产量，构建了枯草芽孢杆菌基因组尺度代谢网络，首次利用基元模式分析获得239个满足菌体生长和产物合成的代谢模式；根据通量相关性与通量灵活度分析预测出12个对菌株异丁醇生物合成影响最显著的靶基因——乳酸脱氢酶基因ldh和丙酮酸脱氢酶复合体E2亚基编码基因pdhC，通过基因敲除手段构建高产基因工程菌，验证在分批补料（好氧/微氧，初始葡萄糖浓度10g/L）条件下，发酵罐异丁醇产量达到5.5g/L，提高了70%，得率达到0.31C-mol 异丁醇/C-mol葡萄糖，达到最大理论值的53%。在模型预测指导下，敲除pgi基因，过表达zwf基因和udhA基因后，菌株胞内还原力得到平衡，NADPH浓度提高为对照菌株的2.6倍，在双阶段分批补料条件下，该菌株的发酵罐异丁醇产量达到6.12g/L，提高了11%，得率提高了19%，达到0.37 C-mol 异丁醇/C-mol葡萄糖，达到最大理论得率的63%。