雷帕霉素产生菌基因组尺度代谢网络模型及强化研究

本申请根据吸水链霉菌基因组注释信息和文献实验信息，获得基因-蛋白-反应的对应关系，并完善反应信息、填加细胞合成反应、填加运输反应、填补网络缺口和确定维持能，对模型进行修正和调试，使计算结果符合实验数据，构建出吸水链霉菌基因组尺度高质量代谢网络模型；建立模型所有生化反应的代谢通量平衡方程，通过基因组尺度高质量代谢网络定量化分析，在基因组尺度上模拟考察敲除和过表达相关功能基因后对雷帕霉素合成的影响，识别雷帕霉素生物合成的限速步骤、关键节点和关键途径，确定目标基因改造；基于确定的目标基因，对吸水链霉菌进行定向改造，通过基因操作扩增目标基因以加强限速步骤通量，敲除相关基因减弱支路途径通量，扩增正调控基因，敲除负调控基因，获得重新设计的理性基因工程菌，开展发酵技术优化研究，获得具有我国自主知识产权的高产雷帕霉素基因工程菌及发酵技术。

本项目依据NCBI和KEGG等数据库中Streptomyces hygroscopicus ATCC 29253的基因组等信息，首次成功构建了雷帕霉素生产菌株的基因组尺度代谢网络模型，并联合代谢通量平衡分析方法和最小代谢调节分析方法对影响雷帕霉素高效合成的关键代谢途径和关键代谢酶/酶系进行了模拟及预测，模型预测结果对关键基因（gapN）改造后的发酵结果显示，雷帕霉素产量得到了有效提升。以Streptomyces hygroscopicus ATCC 29253为出发菌株进行诱变筛选获得了一株雷帕霉素高产菌株S. hygroscopicus U1-6E7（196 mg/L），并采用代谢轮廓分析方法对该菌株胞内代谢进行分析，发现赖氨酸是影响雷帕霉素高效合成的显著性因素，赖氨酸外源补料实验中雷帕霉素产量可达到417 mg/L，与菌株U1-6E7发酵水平相比，提高了112.7%。采用氨基酸代谢轮廓分析法比较原始菌与诱变菌株间胞内氨基酸库变化的结果显示，赖氨酸、缬氨酸、色氨酸、异亮氨酸、谷氨酸、精氨酸和鸟氨酸等7种氨基酸以及二氢吡啶二羧酸合酶、丙酮酸羧化酶和赖氨酸环化脱氨酶等3种关键酶对雷帕霉素的高效合成具有显著影响。在其理性指导下，通过添加不同浓度的赖氨酸进行雷帕霉素的高效发酵优化实验，结果显示当添加5 g/L赖氨酸时，诱变菌株的雷帕霉素产量达到435.7 mg/L。此外，为了进一步提升雷帕霉素的发酵产量，项目中首次分析了雷帕霉素菌株形态与雷帕霉素产量间的相关性，并通过菌体胞内代谢组学研究策略成功解析出19种潜在的能显著影响菌体形态和雷帕霉素产量的关键代谢物，通过对上述潜在的关键代谢物的代谢途径和菌球形态特征进行分析，发现溶氧是影响雷帕霉素产量的关键因素，通过搅拌转速和曝气率等发酵参数优化，最终使得雷帕霉素的发酵产量达到536mg/L，较出发菌株雷帕霉素产量约提升了63.9%。