基于酿酒酵母缬氨酸代谢的异丁醇生物合成基础研究

Isobutanol can be a better new biofuel with huge market potential due to its higher energy density and octane number, lower hygroscopicity and corrosivity, the possibility of usage outside the fuel industry as well. Saccharomyces cerevisiaeis is a potential alternative host for higher isobutanol production due to its more tolerance to isobutanol, its outstanding performance in lignocellulosic hydrolysates and its naturally producing isobutanol. Up to now, strains producing isobutanol have the following shortcomings: (a) the affinities of PDCs to 2-ketoisovalerate are relatively low; (b) byproducts ethanol and glycerol are relatively high; (c) in the ILV2 ILV3 ILV5 overexpression strain, NADPH/NADP+ from pyruvate to 2-ketoisovalerate are imbalance; all these block improvement of isobutanol yield. In this research, aiming at the shortcomings of ILV2 ILV3 ILV5 overexpression strain, we will use molecular biology and genetic recombination technologies to construct Saccharomyces cerevisiaeis cells having higher isobutanol yield, lower glycerol and ethanol yield, and to investigate the mechanisms of improving isobutanol yield. This research would solve the key technologies restricting improvement of isbutanol yield, and also supply scientific foundation for our country's development of isobutanol in the usage of dynamic system of transportation.

异丁醇具有较小的挥发性和腐蚀性、较高的辛烷值和能量密度、且易于储存和运输，是一种新型的具有巨大市场潜力的生物燃料。酿酒酵母由于其对异丁醇的耐受性较好、具有利用纤维素水解物的优势、自身具有合成异丁醇的优势基因等优势，可以作为生产异丁醇的优势宿主菌株。目前，产异丁醇酿酒酵母细胞中脱羧酶PDCs对2-酮异戊酸的亲和力低、副产物乙醇和甘油产量高、由于过量表达ILV2、ILV3和ILV5基因导致从丙酮酸到2-酮异戊酸中辅酶NADPH/NADP+的不平衡等因素是制约异丁醇产量进一步提高的关键。本项目针对目前产异丁醇酿酒酵母细胞中的缺陷，利用分子生物学、基因重组技术改造酿酒酵母细胞，构建异丁醇产量高、副产物甘油和乙醇产量低的酿酒酵母细胞，并研究进一步提高异丁醇产量的分子机制。本研究可解决目前制约异丁醇产量进一步提高的关键技术问题，并且为我国发展生物质异丁醇作为运输动力系统燃料提供相关科学依据。

异丁醇是一种重要的第二代生物燃料。利用酿酒酵母发酵生物合成异丁醇具有重要的理论意义和工业应用前景。本项目基于酿酒酵母缬氨酸代谢途径生物合成异丁醇的过程，研究提高从丙酮酸到异丁醇代谢通量的分子机理，以及研究降低副产物甘油和乙醇生物合成以提高异丁醇在发酵液中比例的分子机制。我们的研究结果表明，运用低拷贝质粒YCplac22-ZWF1过量表达ZWF1基因，可使异丁醇产量提高1.5倍；但若用高拷贝质粒过量表达ZWF1基因，导致ZWF1基因拷贝数过高，反而不利于异丁醇产量的提高。同时我们的结果也表明，降低乙醇生物合成可提高异丁醇产量。在过量表达ILV2基因的菌株中单独缺失PDC6基因、PDC5基因和PDC1基因可使异丁醇产量分别提高1.5、2.1和1.1倍，这表明缺失PDC5基因对异丁醇生物合成的提高影响最大。另外，缺失GPD2基因降低甘油的生物合成可提高异丁醇产量。在过量表达ILV2基因并缺失PDC6基因的基础上再缺失GPD2基因可使异丁醇产量大幅度提高，尤其是在发酵后期。另外，我们也发现在线粒体中过量表达ARO10基因可提高异丁醇产量，但若在此基础上在细胞质中过量表达BAT2基因，反而不利于异丁醇产量的提高；但在缺失PDC6基因的菌株中过量表达ARO10基因可提高异丁醇产量。这些研究结果是该领域的重要发现，为后续研究工作打下了重要的理论基础，具有重要的理论意义。