他克莫司菌株动态代谢调控模型指导下途径改造

This research focuses on the metabolic regulatory mechanism of tacrolimus biosynthesis. Through constructing standard regulatory and structural element for carbon, nitrogen, phosphorus, sulfur metabolism, characterizing and integrating these regulatory modules, assembling and debugging the regulation module system, then a series of metabolic regulatory standard element can be obtained. Based on system biology theory, the genome-scale dynamic metabolic regulatory network for tacrolimus biosynthesis is reconstructed. With the aid of dynamic algorithm and omics the influence of regulatory element on tacrolimus biosynthesis pathway is quantitated. The target genes are identified by modeling the rate-limiting steps, key nodes and pathways. To verify the correction of model and prediction algorithm, the genes amplification and knockout are manipulated to modify the target genes and corresponding pathway fluxes. From a deep prospect, the structure and function of the target enzymes/enzymes system in tacrolimus biosynthesis are elucidated by experiment. On the basis of site-directed mutagenesis technology, the structure of the target enzymes/enzymes system is optimized and then the modified target enzymes/enzymes system are transferred into the Streptomyces host. The results demonstrates an optimized expression of gene cluster and tacrolimus production.

本研究针对他克莫司的生物合成调控行为，通过实验建立他克莫司菌株生物合成的以碳代谢和基因簇代谢调控元件为主，辅助氮代谢、磷代谢、硫代谢的调控元件和结构元件，并进行表征、调控模块设计与集成、调控模块系统组装与调试，获得系列代谢和调控功能明确的标准化元件；基于系统生物学方法，从动态、代谢、调控角度出发，构建他克莫司基因组尺度动态代谢调控网络模型，利用动态通量平衡分析结合组学方法确定调控因子对他克莫司合成途径的定量关系，模拟他克莫司合成的限速步骤、关键节点和关键途径，确定目标基因操作靶点；结合基因敲除和扩增编码和调控基因等分子手段加强流经限速步骤的通量，从深层次角度确定他克莫司合成途径中催化目标酶/酶系的结构和功能作用机制，结合定点突变实验技术，优化目标酶/酶系基因功能域结构，获得性质优良的目标酶/酶系并转接到他克莫司生物合成基因簇中，最终实现整个基因簇的优化表达以及他克莫司的高效优化合成。

本研究首先采用代谢组学、蛋白组学和转录组学等系统生物学方法，从实验角度对他克莫司发酵过程中菌体胞内的碳代谢、氮代谢、磷代谢和硫代谢等代谢途径及其相应的代谢调控元件与潜在作用机制进行了解析，采用WGCNA法发现磷酸戊糖途径、莽草酸途径和天冬氨酸途径与他克莫司的高效合成呈显著正相关性，且上述三条途径极可能为限制他克莫司高效合成的关键限速途径，进一步采用MALDI-TOF/TOF-MS法在外加豆油条件下鉴定了77个差异蛋白点，以及联合代谢组学和转录组学技术在不同化学触发剂及其组合处理下识别出PKS和SigE和AraC家族调控因子等多个显著差异表达基因可能为FK506合成过程中潜在的胞内代谢调控靶点，并解析了胞内代谢的动态响应机制。在此基础上，通过精确设计动态模型框架、动态约束和常微分方程等模块条件，成功构建了筑波链霉菌基因组尺度动态代谢网络模型，进一步采用动态通量平衡分析算法对动态模型进行了参数敏感性和模拟预测准确性等模拟分析。随后，通过动态通量平衡分析和最小代谢调节分析耦合算法进一步对他克莫司合成的限速步骤、关键节点和关键途径进行了模拟预测，并成功识别出52个敲除靶点和29个过表达靶点。依据所有预测靶点的fPH值排序结果，分别选取gcdh、tktB、ask和msdh四个靶基因分别进行了单基因和多基因组合后的基因工程改造，构建的所有的工程菌株均能够有效提升FK506发酵产量，其最高产量可达126.61mg/L，较出发菌株提高了2.29倍。进一步对上述关键基因对应的酶促反应涉及的代谢途径进行分析发现，通过对上述目标酶进行改造后，可有效减少他克莫司的副产物子囊霉素的乙基丙二酰辅酶A前体合成途径通量，和提升他克莫司合成前体途径中的派克酸合成途径、磷酸戊糖途径以及甲基丙二酰CoA合成途径的代谢通量，进一步结合外源添加相关前体和化学触发剂，他克莫司产量最终可达303.6mg/L。