半胱氨酸及同型半胱氨酸高选择性双光子荧光探针及其在活细胞成像中的应用

Cysteine (Cys) and Homocysteine (Hcy) are expressed in eukaryotic cells simultaneously, and there only is a nuance in a methylene. But the tiny difference leads to a significantly different function:Cys is a amino acid which constructs proteins and glutathione; while excess of Hcy was shown to be a risk factor for cardiovascular and Alzheimer's diseases.Thus it has important value in molecular cell biology to highly selectively give separate fluorescent imaging of intracellular Cys and/or Hcy.Due to the juvenility of fluorescent probes which can separately probe and bioimage intracellular Cys with high selectivity, the lack of fluorescent sensors for Hcy which possesses not only the high selectivity but also performance imaging intracellular Hcy and the infantility of two-photon fluorescent probes for Cys with high selectivity and by which the fluorescent imaging can be given in two-photon fluorescent microscopy, the project has been applied on the basis of proposer's previous works. On the basis of two-photon fluorescent materials with water-solubility and permeability to cell membrane, two-photon fluorescent probes containing aldehydes will be synthesized. The aim to probe Cys and Hcy selectively may be carried out by modulating the electronic structures of fluorescent sensors containing aldehydes and adding the groups interfering midbody. In this project, the two-photon fluorescent probes possessing the potential imaging intracellular Cys and Hcy with high selectivity will be synthesized and their fluorescent bio-imaging in living cells should be realized by two-photon fluorescent microscopy.

半胱氨酸（Cys）与同型半胱氨酸（Hcy）同时表达在真核细胞内，结构上只有一个亚甲基的差别，但功能不同：Cys是构成蛋白质和谷胱甘肽的氨基酸；Hcy与人类的心血管疾病、进行性老年痴呆症有直接关联。高选择性地分别实现Cys及Hcy的细胞内荧光成像具有重要的分子细胞生物学意义。针对目前高选择性识别并成像细胞内Cys的荧光探针尚不成熟、识别并成像细胞内Hcy的荧光探针尚无报导、高选择性识别并利用双光子荧光显微镜成像细胞内Cys的双光子荧光探针刚刚起步的状态，结合申请人的工作基础提出本课题。本课题将以具有活细胞通透性的水溶性双光子材料为基础研制含醛双光子荧光探针，通过调整探针分子的电子结构、引入中间体干扰基团等技术实现探针对Cys及Hcy的高选择性识别。课题将提供具有高选择性成像活细胞内Cys及Hcy潜力的双光子荧光探针并利用双光子荧光显微镜实现其在活细胞中荧光成像。

生物荧光探针之所以为科学界所重视，是因为它们能够在众多物质与结构共存的细胞中，选择性地结合一种特定的组分或构件，如分子、离子、生物大分子，细胞器、以及细胞器中的超微结构等，使其、且只使其发出荧光，从而使人们能够利用荧光显微镜看见并成像细胞中尺度微小的特定物质。而且，理论上，荧光成像不受尺寸限制。本项目在执行过程中研制了如下新型的生物荧光探针：.① 靶标为半胱氨酸(Cys)与同型半胱氨酸(Hcy)的荧光探针。利用醛基能够在室温条件下和细胞内环境中高选择性地与Cys及Hcy结合，并生成thiazolidine 及thiazinane的特性，通过在荧光团的恰当位置引入醛基设计、制备荧光探针。由于醛基的吸电子作用可使含醛荧光团不再具备荧光发射性能。而在醛基与Cys及Hcy结合并生成thiazolidine 及thiazinane之后，荧光得到恢复，这样的分子即成为Cys及Hcy的“光开关”型荧光探针。本课题中我们创造性地使用了烯醛基团，得到了具有超高选择性的半胱氨酸探针的荧光探针HOTA，以及可以同时成像半胱氨酸和同型半胱氨酸的荧光探针CB1。.② 利用长烷基链可以使荧光团靶向细胞质膜的特性，设计、制备了细胞质膜探针。在本课题中，我们首次把两条长烷基链与在聚集态与分散态发光颜色不同的荧光分子有机结合，制备了可以同时、原位、区别成像细胞质膜内脂筏微畴与非脂筏微区的荧光探针。这是一个原创性的研究成果，其意义在于丰富了聚集/分散型单分子双靶标荧光探针，为生物荧光探针带来全新的科学知识和科研生长点。.③ 针对国际上非常关注的广义RNA探针，我们提出的V-型共轭体系模型得到了国际上的认可。在以往研究的基础上，本课题又成功研制了具有红色发光性能得双光子广义RNA探针。.④ 利用具有恰当的离子(回转)半径的阳离子化合物能够靶向线粒体的功能，本课题设计了成像活细胞线粒体的荧光探针。我们把具有双光子转子性质的有机荧光分子经化学修饰为有机阳离子，进一步合成了具有超高信噪比的、红色荧光的、双光子线粒体荧光探针，在双光子显微镜上实现了高保真成像。