CUEDC2/ASK1复合物调控内质网应激介导的JNK信号通路激活及细胞凋亡的机制研究

ER stress is induced by the accumulation of unfolded protein aggregates in the endoplasmic reticulum by a variety of stimuli and pathological conditions. ER stress triggers an evolutionarily conserved series of signal-transduction events, which constitutes the unfolded protein response. These signalling events aim to ameliorate the accumulation of unfolded proteins in the ER; however, when these events are severe they can induce cell death. It is believed that the activation of JNK pathway is critical for ER stress-induced cell death. CUEDC2 is a recently identified protein by our lab. In our previous work, we found that CUEDC2 is involved in the regulation of many cell signal pathways, mostly by protein-protein interactions (Nat Immunol, Nat Med, et al). In this study, we found that CUEDC2 regulates ER stress-induced JNK pathway activation and cell death, and more importantly, it interacts with the key kinase ASK1 in JNK pathway. Based on these observations, we plan to use multiple methods including immunopricipitation, kinase assay, cell death assay in the CUEDC2 knockdown cells and knockout mice to better understand the molecular mechanism by which CUEDC2/ASK1 complex regulates ER stress-induced JNK pathway activation and cell death. Our study will shed light on the mechanisms of ER stress related diseases.

内质网应激（ER stress）是指由于各种生理或者病理的原因，内质网中积累大量错误折叠蛋白质，导致内质网结构和功能异常。多种刺激及病理情况会诱导内质网应激,持续的内质网应激反应会诱导细胞凋亡，在此过程中JNK信号通路的激活至关重要。CUEDC2是本课题组发现的一个新基因，参与了多条重要信号通路的调控（Nat Med 2011,共同第一作者；J Biol Chem 2012，共同通讯作者；Nat Immunol 2008等）。前期工作中我们发现CUEDC2能促进内质网应激诱导JNK信号通路激活，并能结合JNK信号通路的关键激酶ASK1。在此基础上，我们将利用已有的CUEDC2基因沉默细胞模型和基因敲除动物模型，通过免疫沉淀、磷酸化检测、凋亡分析等手段深入研究CUEDC2/ASK1复合物调控内质网应激诱导的JNK信号通路及细胞凋亡的具体分子机制，为阐明内质网应激相关疾病的分子机制提供新线索。

多种刺激及病理情况会诱导内质网应激（ER stress），持续的内质网应激反应会诱导细胞凋亡。在此过程中，JNK信号通路的激活至关重要。.CUEDC2是本课题组发现的一个新基因，参与了多条重要信号通路的调控。前期工作中我们发现CUEDC2能促进内质网应激诱导JNK信号通路激活，并能结合JNK信号通路的关键激酶ASK1。基于此，我们利用已有的CUEDC2基因沉默细胞模型和基因敲除动物模型，通过免疫沉淀、磷酸化检测等手段深入研究了CUEDC2/ASK1复合物调控内质网应激诱导的JNK信号通路及细胞凋亡的具体分子机制。我们发现干涉CUEDC2使得Tg激活的JNK活性明显减弱，表明 CUEDC2对ER stress 激活JNK通路调控具有特异性。进一步我们验证CUEDC2与ASK1的相互作用，同时利用CUEDC2与ASK1不同结构域缺失突变的表达载体，精确分析二者发挥相互作用的区域，发现ASK1的C端区域结合CUEDC2，单独的激酶结构域无法结合CUEDC2；而CUEDC2则是通过C末端区域结合ASK1的，同时我们还通过共定位实验，明确CUEDC2及ASK1在细胞胞浆内存在共定位。而且我们还发现DTT引起的内质网应激能够增强CUEDC2与ASK1的相互作用。在进一步的机制研究中我们发现稳定干涉CUEDC2抑制了热激后恢复以及持续热激诱导的HSP70的表达。提示CUEDC2参与了热休克反应，并且将检测HSP70伴侣活性的质粒pRSVLL/V转入细胞，发现在细胞中过表达CUEDC2抑制了HSP70的伴侣活性，而将不能与HSP70结合的CUEDC2截短突变体1-133转染入细胞，发现该突变体对荧光素酶的复性率没有明显的影响，进一步证明CUEDC2能够影响HSP70的伴侣功能，可能具有HSP70共伴侣的特性。HSF1是热休克反应过程中最重要的转录因子，我们利用双荧光报告系统实验检测了干涉和过表达CUEDC2对热激诱导的HSF1的转录活性的影响，转染HSE-Luc到稳定干涉CUEDC2的Hela细胞中，发现稳定干涉CUEDC2抑制了热激诱导的HSF1的转录活性。.综上， 我们揭示了CUEDC2是内质网应激调控中的重要分子，不仅对CUEDC2的功能有了更深的了解，而且为内质网应激相关疾病，如神经退行性疾病、心脏疾病以及肿瘤的发生及干预提供了新的靶点。