GPX4蛋白翻译后修饰与男性不育的关联性及其对精子功能调控的研究

GPX4 is a moonlighting protein with both enzyme activity and structural function. GPX4 is mainly located in mitochondria regions in mature sperm. Previous studies showed that the expression of sperm GPX4 is associated with male infertility. However, these studies are limited in the level of whole protein expression. Recently, we found that GPX4 is a complex protein with N-linked glycosylated, acetylated and phosphorylated sites. PTM sites usually play important roles in protein activity, structure and stability. N-linked glycosylation, acetylation and phosphorylation are highly associated with sperm functions. Thus, in the present study, we will first study the associations between human GPX4 sites and male infertility, and compare the results with the whole protein level. We will also identify the corresponding sites of mouse Gpx4. And based on site specific mutation strategy and spermatogenesis mouse model, we will also select representative sites and study their regulatory functions in mature sperm. The aim of this study is to determine the clinical applications and functional roles of GPX4 at the level of PTM, and will provide novel insights for the identification of biomarkers for male infertility and sperm functions.

GPX4是一种发挥酶活性和结构作用的多功能蛋白质，其在成熟精子中主要定位于中段线粒体区域。已有研究表明GPX4的表达与男性不育具有一定的关联性，但目前对GPX4的功能研究仅局限于表达量变化的关联性，申请人近期的研究结果表明GPX4是一种发生N连接糖基化、乙酰化和磷酸化的复杂修饰蛋白质。翻译后修饰位点作为重要的功能位点，通常决定着蛋白质的稳定性、结构和活性，其中N连接糖基化、乙酰化和磷酸化修饰都与精子功能密切相关。因此，本研究首先将评估GPX4各修饰位点的表达与男性不育的关联性，并与蛋白质整体表达水平进行比较。其次，我们还将鉴定小鼠精子Gpx4各修饰位点，并筛选代表性的修饰位点，基于位点特异的突变策略，结合精子发生重构模型，深入分析修饰位点对精子功能的调控作用。本研究主要是在翻译后修饰水平探讨GPX4的临床意义和调控功能，将为男性不育标志物的鉴定和精子功能的调控研究提供新的思路。

GPX4是一种发挥酶活性和结构作用的多功能蛋白质，其在成熟精子中主要定位于中段线粒体区域。已有研究表明GPX4的表达与男性不育具有一定的关联性，但目前对GPX4的功能研究仅局限于表达量变化的关联性，申请人近期的研究结果表明GPX4是一种发生N连接糖基化、乙酰化和磷酸化的复杂修饰蛋白质。翻译后修饰位点作为重要的功能位点，通常决定着蛋白质的稳定性、结构和活性。. 因此，本研究旨在分析GPX4各修饰位点的表达与男性不育的关联性，并初步阐释GPX4及其修饰位点对精子功能的调控作用。通过定量蛋白质组学分析，我们发现GPX4整体蛋白表达水平与精子活力和获能等功能无明确相关性，而其K167位点的乙酰化和S112位点的磷酸化则分别与精子活力以及获能事件密切相关，提示GPX4翻译后修饰水平的改变比蛋白质总量的变化更敏感、与其功能和生理病理状态更加相关，可以作为备选标志物以反映精子活力和质量。. 为了探讨GPX4的作用机制，我们利用免疫共沉淀结合质谱鉴定技术鉴定了与GPX4相互作用蛋白，这些相互作用蛋白在精子头部和线粒体等部位均有定位，除参与能量（TCA循环）等代谢通路调控外，大部分还与蛋白质的翻译和mRNA剪切相关，为GPX4下游的调控提供了新的证据。通过对GPX4相互作用调控网络的进一步优化，我们得到了16种核心相互作用子网络，并且聚焦到精子鞭毛蛋白VDAC2可能是GPX4调控精子活力的关键下游蛋白。最后，通过对K167位点修饰前后的三维结构优化和模拟，我们发现K167的乙酰化可通过空间位置效应干扰GPX4的酶活性位点U73发挥调控作用。. 综上所述，本研究不仅能为弱精症的诊断提供了新的思路，也在分子水平初步阐释了GPX4对精子活力的调控机制。.