sCLU通过内质网应激关键蛋白GRP78调控线粒体凋亡通路介导肝细胞癌凋亡抵抗的机制研究

Hepatocellular carcinoma is resistant to apoptosis through a protective mechanism, which can severely affect long-term survival of patients. The internal mechanism is unclear. Recent studies show that the vicarious activation of PI3K/AKT/mTOR pathway is playing a key role in resisting apoptotic stimulation in hepatocellular carcinoma. We found that sCLU may affect downstream apoptosis signaling pathway by regulating the GRP78 mediated PI3K/AKT/mTOR pathway. The database prediction and preliminary experiments confirmed that TRIB3 plays a key regulatory role in the sCLU-GRP78-PI3K/AKT/mTOR pathway, but further confirmation is needed. This project is to regulate the expression of key proteins in the sCLU-GRP78 axis in the ER-stress model in HCC, and to detect the structural changes and protein localization of the cell ER through transmission electron microscopy and confocal microscopy. To explore the mechanism of the interaction between upstream and downstream targets of sCLU-GRP78 axis using dual gene regulation and immunoprecipitation technique. The key regulatory role of TRIB3 in the sCLU-GRP78-PI3K/AKT/mTOR signaling pathway was analyzed in multiple aspects using animal model. This study will establish theoretical and experimental basis for the in-depth study of targeted drugs in HCC.

肝癌通过保护性机制抵抗凋亡对多种药物存在药物抵抗严重影响患者长期生存，其内在调控机制尚不清楚。最新研究表明，PI3K/AKT/mTOR的代偿性活化在肝癌细胞抵抗凋亡信号中发挥关键作用。本课题组前期研究证实 sCLU可能通过调控内质网应激关键蛋白GRP78介导PI3K/AKT/mTOR信号通路影响下游凋亡信号传导，数据库预测及初步预实验表明TRIB3在该轴中发挥关键调控作用，但尚需进一步探索。本项目拟在肝细胞癌内质网应激模型中调控sCLU-GRP78轴中关键蛋白表达，通过透射电镜、共聚焦显微镜等检测细胞内质网结构变化及蛋白定位；利用双基因调控、免疫共沉淀技术探索sCLU-GRP78-PI3K/AKT/mTOR轴上下游靶向调控中的作用机制；联合动物模型等多角度分析TRIB3在该信号通路中的关键调控作用，解析其发挥功能效益的途径及作用靶点，从而为肝癌靶向药物治疗的深入研究提供理论和实验依据。

肝细胞癌死亡率在世界范围内常见恶性肿瘤中排第二位，起病隐匿、发展迅速，极易发生肝内的侵袭和转移，且肝细胞癌能够通过保护性机制克服各种外在应激以抵抗细胞凋亡，使其对化疗药物和靶向药物都存在耐药风险。课题组前期研究发现，sCLU在肝细胞癌凋亡抵抗过程中发挥重要作用，在内质网应激条件下GRP78可能是sCLU调控肝癌细胞内质网应激凋亡通路中的关键蛋白，sCLU-GRP78-PI3K/AKT/mTOR轴介导的线粒体凋亡通路可能是内质网应激凋亡通路的关键机制。本课题组通过科学实验发现，在肝癌细胞模型中，应用衣霉素诱导内质网应激过程，内质网应激可以明显上调sCLU、GRP78、TRIB3等三种关键蛋白的表达，分别调控sCLU和GRP78表达后，再次诱导内质网应激过程，细胞凋亡率明显升高，而精准下调TRIB3表达后细胞凋亡率明显降低，这一过程说明，sCLU和GRP78在内质网应激诱导的细胞凋亡过程中发生抵抗凋亡的作用，而TRIB3在其中发挥促进凋亡的作用。为探索sCLU、GRP78和TRIB3之间精准的调控关系，课题组发现，下调sCLU表达后，GRP78蛋白也明显表达降低，但内质网应激条件可回复GRP78的表达；而下调GRP78蛋白的表达后可以增加TRIB3的表达，但对sCLU蛋白的表达无任何影响。课题组分别应用细胞表型实验精准调控sCLU和GRP78蛋白的表达，检测在内质网应激条件下，细胞凋亡的变化，初步推测出在肝细胞癌内质网应激模型中，sCLU和GRP78可能具有保护细胞功能抵抗外界应激的作用，而TRIB3为其二者可能的下游蛋白，在细胞中起到促进细胞凋亡的作用，在肝细胞癌内质网应激模型中，sCLU-GRP78-TRIB3调控轴可能是其中关键的调控机制。这以结果初步揭示了sCLU通过GRP78-TRIB3-PI3K/AKT/mTOR 轴进行调控的具体机制，进而探究了内质网应激的发生过程，通过对sCLU、TRIB3等多个蛋白的调控，都可以直接或间接地影响内质网应激，为肝癌靶向药物治疗的深入研究提供了理论和实验依据，也为肿瘤的治疗提供了多个治疗靶点和新思路。