具有多种翻译后修饰的Ras蛋白的合成与功能研究

Ras proteins are important cancer-associated proteins and their abnormal activation is closely related to the occurrence of a variety of cancers. In recent years, it has been found that Ras proteins have a variety of protein posttranslational modifications, including: farnesylation, methylation, and ubiquitinaition, which regulate proteins' activity, cell localization and transportation. However, the mechanism how ubiquitination individually, or together with other modifications (like lipidation and methylation, etc.) regulates Ras protein's function remains unclear. One of the main restrictions is the lack of efficient methods for preparing Ras proteins with corresponding modifications. Accordingly, we intend to combine chemical synthesis and biological expression to establish the method of synthesizing Ras proteins with site-specific ubiquitination as well as multi-modifications. Then, those synthetic proteins will be applied to systematically and quantitatively study the effects of site-specific ubiquitination on Ras proteins' bioactivity, to explore if ubiquitination, lipidation and methylation have any synergistic impact on the interaction between Ras proteins and the membrane structure as well as Ras proteins' transportation between the cell membrane. Thus, these studies will explain the mechanism how these multiple posttranslational modifications regulate Ras proteins' function, and provide a possible theoretical foundation for further searching for new anticancer targets associated with Ras proteins.

Ras蛋白是重要的癌症相关蛋白，它的异常活化与多种癌症的发生有着密切关系。近年来，已发现Ras蛋白上具有多种蛋白质翻译后修饰，包括：法尼基、甲基、泛素等，他们调节了蛋白质的活性、定位、转运等过程。但泛素修饰单独调节、以及多种修饰（同时含有泛素、脂基和甲基等）共同调节Ras蛋白功能的机制仍研究的不清楚，其中制约的主要因素之一是缺乏高效的制备具有相应修饰的Ras蛋白的方法。因此，我们拟发挥化学合成法的优势，结合生物表达，建立合成具有定点泛素修饰以及多种修饰的Ras蛋白的方法。并利用所合成的Ras蛋白，系统定量研究定点泛素修饰对Ras蛋白生物活性的影响，研究泛素、脂基和甲基修饰是否协同影响了不同Ras蛋白与膜结构之间的相互作用，以及是否共同调节了Ras蛋白在细胞膜间的转运。从而阐释多种翻译后修饰共同调节Ras蛋白功能的机制，并为进一步寻找Ras蛋白相关新的抗癌靶标提供可能的理论基础。

蛋白质的翻译后修饰是生物体内重要的生物过程，调节着蛋白质的结构和功能，常见的翻译后修饰过程包括：脂基化、磷酸化、甲基化和泛素化等。蛋白质翻译后修饰的调节作用与许多疾病的发生发展相关，如：与癌症相关的Ras家族蛋白，与阿尔兹海默病相关的Tau蛋白等。因此，揭示单个或者多个翻译后修饰如何调控蛋白质的结构和活性，以及通过调控蛋白质的翻译后修饰来调控蛋白质的结构和活性，皆具有重要的科学意义和应用前景。该项目围绕蛋白质翻译后修饰开展了一系列工作，取得了以下研究结果： 1）建立了高效合成具有法尼基化、甲基化和磷酸化修饰的全长K-Ras4B蛋白的方法；2）发展了一种合成非水解磷酸化丝氨酸模拟物的新型简洁高效路线，并应用于磷酸化K-Ras4B蛋白的合成；3）揭示了法尼基化、甲基化、磷酸化等修饰共同调控K-Ras4B蛋白细胞内定位和活性的机制；4）合成了Lys151位泛素化修饰的Ras家族重要成员——Rheb蛋白C段区域（Ras homologue enriched in brain）；5）发展了泛素蛋白定点双荧光标记方法并进一步用于去泛素化酶检测；发现了底物磷酸化能抑制TEV蛋白酶的活性，建立了依赖于多肽磷酸化的动态调节酶切效率的方；6）发展了调控蛋白质多聚泛素化水平的方法并进一步用于降解疾病相关蛋白质。部分研究进展已经以SCI论文的形式发表在了ACS Chem Biol、Cell Chem Biol、Mol Biosyst.、Talanta等刊物上，共5篇，并申请了2项专利。.