胰腺转录因子蛋白高效诱导hES细胞分化为胰岛β细胞及其机制研究

人胚胎干（hES）细胞是糖尿病细胞治疗理想的细胞来源，但如何安全高效地将hES细胞诱导分化为可临床应用的胰岛β细胞是其关键。虽然通过病毒载体将胰腺特异转录因子基因导入hES细胞内，能够诱导后者分化为类胰岛β细胞,但是病毒介导的基因表达难于调控，不能模拟胰岛自然分化过程，因而分化率低，且有生物安全隐患，临床应用价值不大。我们前期实验表明：带蛋白转导域（PTD）的胰腺转录因子融合蛋白PTD-Pdx1能够诱导hES细胞定向分化为类胰岛β细胞。本研究将制备更多的胰腺转录因子融合蛋白：如PTD-Ngn3、PTD-Pax4等，并选择最佳作用浓度、时相与组合，更加精准地调控hES细胞定向分化为胰岛β细胞。本研究特点：1）利用重组蛋白作用浓度、时相和组合可调控的特点，最大限度地模拟胰岛β细胞自然分化过程和提高分化率；2）避免了使用病毒载体，更适合于未来临床应用；3）有望进一步阐明胰腺转录因子相互作用机制。

人胚胎干（hES）细胞是糖尿病细胞治疗的理想细胞来源，为了通过细胞的诱导分化得到可临床应用的类胰岛β细胞，本研究采用人脐带血血浆、可溶性纤连蛋白及细胞因子，成功建立了无饲养层临床级的人胚胎干细胞系用于分化实验。PDX1是胰腺分化过程中关键的转录因子，利用PDX1蛋白可诱导hES细胞分化成胰岛素生成细胞，而去除穿透肽的Mut-PDX1蛋白不能诱导hES细胞分化。以PDX1蛋白诱导分化的实验结果重复性差，可能是由于蛋白的稳定性差。采用新兴的体外合成mRNA的技术合成PDX1 mRNA通过电转可高效进入hES细胞。RT-PCR检测结果表明，PDX1 mRNA可诱导hES细胞分化，表达胰腺关键转录因子NeuroD、Mafa、Nkx6.1、Insulin。免疫荧光检测分化的细胞共表达Insulin和Glucogon，流式检测胰岛素生成细胞的阳性率达33.4%，且分化的细胞在体外通过高糖刺激可分泌胰岛素。采用PDX1 mRNA诱导人脐带间充质干细胞分化为类胰岛β细胞得到了相似的实验结果。通过对比研究在糖尿病小鼠的不同部位移植胰岛对小鼠的存活率及降糖效果的影响，表明在肾被膜下移植可达到理想的效果。分化的胰岛素生成细胞移植到糖尿病小鼠体内5天后血糖开始下降，并逐渐维持在正常水平。切除移植细胞的肾后小鼠血糖上升，免疫荧光检测移植的细胞在肾被膜下存活。