长期常规剂量何首乌暴露下大鼠肝损伤特异性标志物的发现

Polygoni Multiflori Radix (PMR) is a commonly used traditional Chinese herbal medicine. Recently, the PMR-induced liver injury has increasingly attracted attention at home and abroad. Through the implementation of NSFC project (Grant No. 81073007), we have revealed that the metabolic interaction between 2,3,5,4'-tetrahydroxy stilbene-2-O-β-D-glucoside and emodin could cause accumulation of emodin in liver and therefore induce hepatic lesions. In view of the shortages of early diagnosis and traceability of PMR-induced liver injury in clinical practice, this continuous project aims to discover the specific biomarkers in liver injuried rats induced by long-term, normal-dose exposure to PMR, the main researches include: (1) to characterize the footprint of bile acids in blood and urine of rats using metabolites target analysis so as to find the sensitive biomarkers at the early stage of liver injury; (2) to identify and track the anthraquinone-GSH as a potential biomarker in vitro and in vivo. This study is of clinical significance in the early diagnosis, process monitoring and tracing of PMR-involved liver injury, and will strengthen the rational use of PMR and PMR-containing pharmaceuticals.

近年来国内外因服用何首乌及其制剂导致肝损伤的报道逐渐增多。我们通过已结题国家自然科学基金—基于“成分间相互作用致毒性成分靶器官蓄积”假说的何首乌肝毒性成分研究（项目号：81073007），揭示了何首乌中蒽醌类、二苯乙烯苷类在代谢环节存在相互作用，初步阐明了游离蒽醌是产生肝损伤的物质基础。针对何首乌致肝损伤早期诊断和溯源的难题，本项目从临床用药特点出发，开展长期常规剂量何首乌暴露下大鼠特异性标志物的发现研究，研究内容包括：（1）利用代谢靶标分析的方法，对大鼠血液、尿液中的胆汁酸类成分进行“量-时-毒”变化规律分析，发现何首乌致肝损伤的高敏感性标志物；（2）通过“游离蒽醌-代谢活化-加合物生成”的研究路线，在肝细胞、肝微粒体、体外合成及整体动物水平，发现何首乌致肝损伤的可溯源性标志物。本研究对于何首乌及类似含蒽醌类中药可能导致肝损伤的早期诊断、进程监测和溯源具有重要意义。

中药何首乌致肝损伤的临床案例时有报道，其早期诊断指标特异性不强、灵敏度不高，因此探索何首乌致肝损伤的早期、敏感、可溯源的生物标志物，对于何首乌的临床用药安全具有重要意义。.首先，本课题从胆汁酸代谢角度探索发现何首乌致肝损伤的效应标志物。建立长期常规剂量（1 g/kg）给药的何首乌致肝损伤大鼠模型，分别于第3、6和7周（恢复期）收集血样、尿样及肝脏，采用UPLC-QqQ-MS同时定量检测血浆和尿液中17种胆汁酸含量，发现血浆中猪去氧胆酸（HDCA）及尿液中牛磺-β-鼠胆酸（TβMCA）是变化最显著的两个指标，且二者与总胆汁酸（TBA）、总胆红素（TBIL）、谷草转氨酶（AST）、碱性磷酸酶（ALP）等生化指标呈良好相关性，表明此两种胆汁酸类成分可作为何首乌致肝损伤的高敏感性生物标志物。生化指标及病理切片进一步显示何首乌长期给药导致大鼠胆汁淤积型肝损伤，转录组学研究显示胆汁酸合成限速酶Cyp7a1基因上调约31倍，与胆汁酸转运相关的胆盐输出泵（BSEP）表达升高，而钠离子-牛磺胆酸共转运蛋白（NTCP）表达降低，推测何首乌致肝损伤机制与肝脏胆汁酸的合成和排泄紊乱密切相关。.另一方面，本课题还从蒽醌类成分代谢活化致毒角度探索发现何首乌致肝损伤的暴露标志物。体外研究发现，大黄素对原代肝细胞的毒性经CYP3A4诱导剂利福平（RFP）处理后明显上升，经抑制剂酮康唑（KTZ）处理毒性效应得到缓解，而与GSH合成抑制剂L-丁硫氨酸-亚砜亚胺（BSO）共孵育后，细胞存活率显著下降。体内诱导（地塞米松）/抑制（KTZ）模型同样显示抑制CYP3A4在一定程度上可以保护肝脏免受大黄素损伤，表明何首乌毒性与GSH消耗、CYP3A4代谢活化相关。因此，采用UHPLC-QTOF-MS/MS定性检测大鼠体内大黄素-GSH加合物（m/z 574.11），推导大黄素可能的代谢活化途径，并通过UPLC-QqQ-MS定量检测了大鼠血浆、尿液及胆汁中的大黄素-GSH加合物，由此阐明了何首乌致肝损伤与蒽醌-GSH加合物存在相关性，该加合物可作为何首乌致肝损伤的溯源性暴露标志物。.上述关于何首乌致肝损伤的双重标志物研究结果，为目前临床何首乌致肝损伤的早期诊断和溯源提供科学依据。