IFT20/Snapin/SPAG6蛋白复合体通过荷载转运蛋白和自噬作用调节精子发生

Intraflagella transport (IFT) is an evolutionarily conserved mechanism thought to be essential for the assembly and maintenance of most eukaryotic cilia and flagella, recent studies also demonstrate that IFT is involved in autophagy. IFT20, as the only one present in the Golgi bodies and along the cilia among IFT proteins, is necessary for spermatogenesis. Our recent studies demonstrated that sperm associated antigen 6 (Spag6)-deficient mice developed severe spermatogenesis defect, hearing loss, phenotypes shared with the Ift20 mutant mice. Both SPAG6 and IFT20 interact with Snapin, a snare associated protein participating in vesicle trafficking. In vivo, Snapin is highly expressed in the testis, and it is localized in subcellular organelles for flagella assembling in male germ cells. We propose that IFT20, SPAG6 and Snapin form a complex with Snapin bridging the other two proteins to regulate spermatogenesis in vivo. Given that two major phenotypes were discovered in the germ cell specific Ift20-deficient mice: 1) the inability to form normal sperm flagella and 2) the failure of cytoplasm removal, We propose that the complex conduct dual functions: transporting cargos to assemble sperm flagella, and direct normal autophagy to remove redundant cytoplasm. The purpose of this project is to dissect this complex in vitro and in vivo by comprehensive techniques, including yeast three-hybrid, conditional gene targeting methods, and so on. The study will uncover a novel mechanism of spermatogenesis, and provide foundation to treat clinical male infertility.

纤毛/鞭毛内运输机制(IFT)在纤毛/鞭毛形成中发挥非常保守的作用，最新研究表明IFT也参与自噬。IFT20作为唯一同时定位于高尔基体和纤毛的蛋白，参与精子形成。精子相关抗原(Spag6)缺失导致精子发生障碍、听力缺失等，这些表型在已建立的Ift20基因敲除小鼠中也出现。Snapin作为一种荷载转运因子，定位于鞭毛形成相关结构，可同时与IFT20和SPAG6发生相互作用。这三者可能形成复合物以调控精子发生。本研究将在我们探索生精细胞缺失Ift20表现出鞭毛结构异常和胞浆清除功能受损的基础上，利用酵母三杂交、条件性基因敲除等技术，在体外和整体动物水平证明IFT20、Snapin、SPAG6可形成复合物，Snapin是连接IFT20和SPAG6的关键因子，IFT20/Snapin/SPAG6复合物通过荷载转运蛋白形成精子鞭毛和直接自噬作用调节精子发生机制，临床男性不育靶点治疗提供理论依据。

纤毛/鞭毛内运输机制（IFT）在纤毛/鞭毛形成中发挥非常保守的作用，IFT20作为唯一同时定位于高尔基体和纤毛的蛋白，参与精子形成。精子相关抗原(Spag6)缺失导致精子发生障碍、听力缺失等，这些表型在已建立的Ift20基因敲除小鼠中也出现。Snapin作为一种荷载转运因子，定位于鞭毛形成相关结构，可同时与IFT20和SPAG6发生相互作用，这三者可能形成复合物以调控精子发生。本研究计划包括：①建立生精细胞特异性Snapin、Spag6基因敲除小鼠，分析比较其生殖系统表型是否和已有的Ift20基因敲除小鼠表型类似；②验证蛋白复合体形成及Snapin是IFT20和SPAG6之间的桥梁；③以条件性Ift20基因敲除小鼠（Ift20 KO小鼠）为实验对象，探讨IFT20/Snapin/SPAG6 复合体通过直接的细胞自噬作用清除多余的胞浆。结果发现：①Snapin定位于精子顶体和精子领，SNAPIN蛋白C端（79-136）是与SPAG6发生作用的结构域，SPAG6主要通过编码核苷酸199→280区域与Snapin结合。除Snapin外，SPAG6还可与COPS5、SPINK2、SPAG16L等发生作用，其中Snapin、COPS5、SPINK2是与SPAG6发生最强作用的蛋白（非常有趣的是，IFT20也与Snapin、COPS5、SPAG16L发生强烈相互作用）。②Ift20基因敲除后，不能荷载转运蛋白ODF2和SPAG16L抵达正确部位以组装鞭毛结构；自噬核心蛋白ATG16L表达明显降低，但LC-3和泛素蛋白表达无变化。③IFT20分别通过与COPS5、Spata1、Gmap210等蛋白的相互作用，影响了精子发生过程。④延展性地研究发现其他IFT蛋白（IFT172、IFT74、IFT81、IFT25）影响小鼠生育能力、精子数量及精子鞭毛组装过程。项目执行计划中的Spag6生精细胞特异性敲除小鼠（Spag6 KO小鼠）的构建，目前已用Crisper-Cas9的方法获得F1代小鼠；已建立Snapin floxed小鼠并与4种Cre小鼠分别进行交配，均不能完全剪切掉Snapin，需用Cre表达更早更强的工具小鼠尝试建立Snapin KO小鼠，因此后续将用Spag6 KO小鼠在1年内完成相关实验。成果将为纤毛/鞭毛内运输、蛋白-蛋白间相互作用参与精子发生机制提供证据。