SET蛋白调节精子发生及其作用机制的研究

Phymatological study showed that SET protein was involved in various biologic functions, such as cell cycle, DNA replication, protein phosphorylation, chromosome modification, nucleosome assembly and apoptosis regulation. In previous studies, we found that SET protein was mainly expressed in spermatophore, spermatocyte, including haploid and tetraploid spermatogenic cells, in testes of rat and mouse, which suggested that SET protein played roles in spermatocyte meiosis and spermiogenesis. In this study, mouse cell lines of spermatophore and spermatocyte, GC-1 and GC-2, as well as the sorted spermatogonia stem cells (SSCs), were cultured in vitro, and then transfected with the constructed adenovirus vectors of SET gene and SiRNA for overexpression and RNAi of SET protein. The cell proliferation, differentiation and apoptosis were analyzed, spermiogenesis was also analyzed by an essential histone acetyltransferase and HAT analysis. After that, those molecules interacted with SET protein will be find by the methods of co-immunoprecipitation and mass spectrum to understand the pathways of SET protein. Meanwhile, we will compare the SET protein expression in testicular biopsy tissues between normal spermatogenesis men and infertility patients. By those studies, the regulation and mechanism of SET protein in spermatogenesis will be stated, which is also beneficial to explore male infertility in clinical practice.

SET蛋白是多任务处理蛋白，调节细胞周期中DNA复制、核小体装配、染色体修饰和细胞凋亡等生物过程。我们研究发现，SET蛋白表达于大小鼠精原细胞和精母细胞；在小鼠单倍体和四倍体生精细胞中均有表达，提示该蛋白参与精母细胞的减数分裂和精子细胞的变形过程。本课题体外培养小鼠精原细胞系GC-1、精母细胞系GC-2、分选精原干细胞SSCs为模型，采取腺病毒载体转染超表达SET蛋白和SiRNA，分析SET蛋白在精原细胞增殖、分化、凋亡中的作用；分析精子细胞的组蛋白乙酰基化和去乙酰基化，阐述SET蛋白在精子形成中的作用；进一步通过免疫共沉淀和质谱等技术寻找SET蛋白相互作用的分子，阐述其作用机制；分析生精功能障碍病人睾丸组织中的SET蛋白表达，了解其与男性不育的相关性。该研究阐述SET蛋白调节精子发生的作用，对临床少弱畸形精子症男性不育的研究也有重要意义。

SET蛋白主要表达于睾丸生精小管中的精原细胞、精母细胞，以及间质细胞的细胞质及细胞核内。首次阐述了SET蛋白正向调节Leydig细胞中STAR、雄激素合成相关酶CYP17、3β-HSD的表达，从而调节Leydig细胞雄激素的合成；SET蛋白促进P450c17裂解酶活性而PP2A抑制P450c17裂解酶活性，PP2A在SET蛋白调节的睾酮合成中的中心位置。SET蛋白在精原细胞GC-1和精母细胞GC-2细胞中高表达，且SET蛋白在GC-1和GC-2细胞核和胞质中都有表达，胞浆多于胞核。干涉SET表达抑制精原细胞和精母细胞的增殖，显著增加GC-1和GC-2细胞的凋亡率。降低SET蛋白表达，特异性抑制AKT的S473位点磷酸化和AKT信号通路,抑制精原细胞和精母细胞增殖。Cleaved-PARP和Cleaved-caspase3的表达显著增加；Cleaved-caspase9和BAX增加的表达增加、BCL2表达减少，表明SET蛋白通过内源性和外源性信号通路调节生精细胞GC-1 spg和GC-2spd细胞凋亡。此外，构建SETlox/+、EⅡacre/+超表达SET转基因小鼠，Set在睾丸中的原始表达量远高于其它各组织，在体验证了SET蛋白的上述作用。完善SET上下游蛋白调控网络，将有助于进一步阐明SET蛋白在生殖配子发生、激素合成及磷酸化tau蛋白形成中的作用。SET基因核心启动子位于-157bp至+47bp之间。ZFX转录激活SET启动子活性，本课题ZFX-SET调控轴的发现扩大了ZFX目的基因谱，完善了ZFX蛋白下游蛋白网络；ZFX蛋白生理功能的发挥，可能经由调控多功能蛋白SET而实现。本课题还阐述了SET蛋白在精子形成中的作用。SET蛋白能有效抑制组蛋白H3、H4的乙酰化。SET蛋白不调节组蛋白乙酰化酶（HATs）的表达，也不调节组蛋白去乙酰化酶（HDACs）的表达，但SET蛋白通过与组蛋白H3、H4直接结合从而调节组蛋白H3、H4的乙酰化，即阻止其赖氨酸乙酰化位点的暴露，抑制H3、H4的乙酰化，因而调节精子形成。综上所述，本课题阐述SET蛋白调节睾丸雄激素合成及其细胞内分子信号机制，阐明了SET蛋白调节精子发生和精子形成的作用，对于深入研究睾丸内因子调节雄激素生成和精子发生的基础理论、对临床少弱畸形精子症男性不育的研究都具有重要意义。