Fsp27基因突变影响阿勒泰羊臀脂沉积能力的分子机制研究

Fat specific protein 27 (Fsp27) is an important factor regulating fat deposition and metabolism with its N-terminal domain promoting the formation of lipid droplets in adipocyte. However, the bio-function role of its C-terminal domain is still unclear. Our previous study revealed that a missense mutation of C-terminal was highly associated with the trait of Altay sheep rump-fat, suggesting Fsp27 gene may be involve in the lipid droplets formation of Altay sheep tail fat. Accordingly, this project will focus on the association analysis between the missense mutation SNP in Fsp27 gene C-terminal and sheep fat tail traits, and elucidate the biological function of Fsp27 gene C-terminal in lipid droplet formation by using five types of tail trait in sheep population. This project will construct the truncated, mutant and wild-type of Fsp27 gene N- and C-terminals expression vector respectively, then transfect 3T3-L1 and 293T cell lines, and finally test the effects of various carriers for fusion and formation of lipid droplet by using some techniques of fluorescence localization, live cell imaging, separation of lipid droplets and immunoprecipitation. The study aims to verify the role of Fsp27 C-terminal and its SNP in the formation of lipid droplets in fat tail, and provide a scientific basis for revealing the genetic mechanism of fat tail trait in sheep.

脂肪特异性蛋白27（Fsp27）是一种调控脂肪沉积与代谢的重要因子，其N端结构域能促进脂肪细胞脂滴形成，然而其C端结构域的作用至今仍不明晰。本课题组前期研究结果首次发现其C端有一处错义突变与阿勒泰羊臀脂性高度关联，提示Fsp27基因可能在阿勒泰羊臀脂脂滴形成中扮演重要角色。基于此，本项目以五种脂尾性状类型绵羊群体为研究对象，以发现的Fsp27基因C端错义突变SNP的功能解析为科学问题，探索该SNP与绵羊脂尾性状的关联性及其在脂滴形成中的生物功能。为此，本研究拟分别构建Fsp27基因N、C端截短体以及突变型和野生型Fsp27基因表达载体，转染3T3-L1和293T细胞，并采用荧光定位、活细胞成像技术、脂滴分离、免疫共沉淀等技术检测各种载体对于脂滴融合与大脂滴生成能力的影响。本研究将证实Fsp27 C端及其SNP在绵羊尾脂脂滴形成中的作用，为解析绵羊脂尾性状的遗传机制提供科学依据。

绵羊脂尾（臀）性状是一种逆境生存所必需的生物性状，其形成与脂滴在脂肪组织的合成与代谢中发挥的作用密不可分。研究表明脂肪特异性27 kDa蛋白（Fsp27）在脂滴形成中发挥重要作用。本项目利用qRT-PCR方法检测了营养充足期阿勒泰羊不同组织、营养充足期和营养匮乏期阿勒泰羊尾脂组织中Fsp27基因的表达情况进行了定量分析。结果表明，Fsp27基因在营养充足期阿勒泰羊尾脂中高表达，极显著高于心、肝、脾、肺、肾、胃、肠、皮肤和骨骼肌组织（P＜0.01）。表明Fsp27基因在阿勒泰羊尾脂中高表达，且其在尾脂中的表达量与阿勒泰羊的营养状态密切相关。同时采用PCR-SSCP结合测序技术检测了不同尾脂沉积能力绵羊品种（脂尾型绵羊品种阿勒泰羊、短脂尾型绵羊品种小尾寒羊和湖羊、长瘦尾型绵羊品种中国美利奴细毛羊和萨福克羊）Fsp27基因的突变情况，共检测到了25个突变位点，其中，上游区域7个，5’ UTR区9个，外显子区域3个，内含子区域3个，3’ UTR区3个。随后选取7个在小样本（每个品种21头）检测结果中在不同绵羊品种群体中存在分布差异的位点在大样本群体中开展检测，进一步确定其与绵羊尾脂沉积能力的关联性。发现Fsp27基因第3外显子g.16771741位点G/A突变在尾脂沉积能力较强的阿勒泰羊、小尾寒羊和湖羊群体中以G等位基因为主，而在尾脂沉积能力较差的中国美利奴细毛羊和萨福克羊群体中以A等位基因为主；第5外显子 g.16774969位点 C/T突变在阿勒泰羊中没有检测到CC基因型，而在长瘦尾的中国美利奴细毛羊和萨福克羊群体中没有检测到TT基因型；5’ UTR区g.16767527位点 C/A突变在阿勒泰羊群体中以CC基因型为主，基因型频率为0.869；小尾寒羊和湖羊群体中以CA基因型为主，基因型频率分别为0.698和0.628；中国美利奴细毛羊和萨福克羊群体则以AA基因型为主，基因型频率分别为0.616和0.833； g.16767779-16767780位点GG/TG突变；在尾脂沉积能力强的阿勒泰羊、小尾寒羊和湖羊群体中以TC为优势等位基因，在尾脂沉积能力差的中国美利奴细毛羊和萨福克羊群体中则以GG等位基因为主。以上4个突变位点均与绵羊尾脂沉积能力高度相关，可以作为理想的分子标记用于低脂肪绵羊品种的选育。