msx1诱导成骨细胞逆分化用于骨组织工程的实验研究

Bone tissue engineering is one of the most promising stragedies of repairing critical-sized bone defect.However,the application of existing candidates for seed cells is very limited because of obvious shortcomings. Amphibians have obtained vigorous capability of regeneration through a “dedifferentiation-proliferation-lineage-restricted redifferentiation ” method in mature cells of blastema, which is closely related to homebox gene msx1. We suppose “lineage-restricted” dedifferentiation can be achieved in msx1 transfected osteoblast, obtained osteogenic progenitor cells can maintain osteogenic differentiation and possess stronger proliferation capability, so as to improve osteogenic efficiency. The introduction of “Tet-off” control system enables the course of dedifferentiation more controllability. Therefore, we hope to obtain more efficient and safer seed cells in a controllable dedifferentiation stragedy. We will also investigate the role of Wnt signaling passway and attempt to reveal its key Points. To verify the osteogenic efficacy of seed cells, a series of expeiments on osteogenic differentiation both in vitro and in vivo will be employed. We prospect to find a promising novel source of seed cells, probe its signaling mechanism and lay experimental foundation for further application.

骨组织工程是修复大段骨缺损最具应用前景的治疗策略之一，但现有的候选种子细胞均具有显著缺陷从而限制其应用。有尾两栖类通过芽基中成熟细胞“逆分化—增殖—定向再分化”途径获得了极强的再生能力，该再生能力的获得与msx1基因密切相关。据此设想，通过msx1基因转染成骨细胞可诱导其发生“谱系特异性”逆分化，获取的成骨前体细胞在保证固有的成骨分化方向的同时，具有更强的增殖能力，从而显著提高成骨效能。而“Tet-off”调控系统的引入则赋予了此逆分化过程很强的可控性。藉此我们可望通过一种可控的逆分化途径获取高效而安全的种子细胞。本研究中还将探讨在上述逆分化及再分化过程中Wnt信号通路发挥的作用并尝试揭示作用的关键环节。为验证种子细胞的成骨效能，拟采用体内外系列成骨分化实验加以评估。我们希望通过逆分化途径为骨组织工程提供一种具有广泛应用前景的新种子细胞来源，并初步探讨其信号机制，为进一步应用奠定实验基础。

通过成熟细胞“逆分化-增殖-定向再分化”是获取具有优秀再生能力的骨组织工程种子细胞的一项新思路。本研究将同源盒基因msx1 转染到成骨细胞中，并且通过 “Tet-off”分子开关实现对 msx1 基因表达的特异性时空调控，旨在获得一种安全高效的种子细胞。研究内容包括三方面：（1）转染msx1基因诱导成骨细胞逆分化；（2）成骨细胞逆分化及再分化过程中的经典Wnt 信号机制；（3）逆分化后的成骨前体细胞用于骨组织工程的初步实验研究。我们从绿色荧光蛋白转基因小鼠颅骨中分离培养成骨细胞，并且通过所构建的含有“Tet-off”分子开关及目标msx1基因的慢病毒载体成功转染该细胞，研究表明：（1）与未转染组(non-msx1 group)相比，转染组(msx1 group)细胞中：早期骨分化的标志基因Runx2表达水平显著上调而中晚期分化标志OPN及OCN均显著下调；细胞体积变小，核浆比例增高，溶酶体减少；增殖指数显著增高。(2)转染组逆分化过程中β-catenin的mRNA表达水平显著下调而再分化过程中显著上调，伴之成骨分化相关基因表达水平的显著下调或上调，使用特异性拮抗剂DKK1和激动剂Wnt3α能分别拮抗或增强这一效应。(3)体外成骨分化试验以及裸鼠体内异位成骨、颅骨缺损修复模型中，转染组均表现出成骨能力的显著增强。本实验结果证明了msx1能有效的逆分化成骨细胞，该细胞在定向再分化过程中的成骨分化能力得到显著增强，经典Wnt信号通路通过效应因子β-catenin参与了该过程的调控。本研究成果为寻找骨组织工程理想的种子细胞提供了一种新选择，并且通过对Wnt 信号机制的研究，有助于将来直接通过信号通路调控，更为便捷的实现逆分化及再分化过程，从而为该种子细胞将来的广泛应用奠定坚实的理论和实践基础。