硫碱弧菌（Thialkalivibrio versutus）D301氨基谷胱甘肽介导的聚硫化物跨膜转运机制及其调控硫代谢功能研究

Transmembrane transport of polysulfide is a key step in microbial hydrogen sulfide oxidation, but the transport pathways and mechanisms are not yet clear. Based on the transcriptome data and conservative sequence alignment of alkalophilic sulfur oxidizing bacteria, Thialkalivibrio versutus D301, we identified the coding gene cluster of polysulfide transporter (GTTin/out). In this research, transmembrane transport mechanism of polysulfide and its regulation of sulfur metabolism will be studied. In the specific experimental scheme, in vitro and in situ analysis techniques will be adopted to explore the reaction law between polysulfide and its activation carrier amino glutathione (GASH), and determine the composition of GASH persulfide (GA(S)nH). Using the gene operating system of Thialkalivibrio versutus D301, the missing mutant was constructed to verify the function of the coding genes. Biochemical and molecular biological methods, like protein structure analysis, specific substrate binding, reverse membrane capsule experiment, will be used to explore the structural characteristics of GTTin/out protein and the transmembrane transport mechanism of poly sulfide. And then, the key role of poly sulfide transmembrane transport in the regulation of sulfur metabolism will be analyzed by the isotope labeling and transcriptome analysis. This research will be helpful to reveal the mechanism of sulfur transmembrane transport and the regulation of sulfur metabolism in Thialkalivibrio versutus, and further improve the basic theory of microbial sulfur metabolism. It will also enhance the biodesulfurization process.

聚硫化物跨膜转运是H2S生物氧化途径中的关键步骤，但其转运途径和机制仍不清楚。本课题组通过对嗜盐嗜碱硫碱弧菌D301全基因转录组数据分析和保守序列比对，确定了聚硫化物转运蛋白（GTTin/out）的编码基因簇。本项目拟开展聚硫化物跨膜转运机制及其调控硫代谢功能研究。首先借助体外实验和原位分析技术，研究聚硫化物与活化载体——氨基谷胱甘肽（GASH）的反应规律，确定聚硫化物的活化形式；利用硫碱弧菌基因编辑系统，构建缺失突变体，验证编码基因功能；借助生物信息学方法、蛋白结构分析、特异底物结合、翻转膜囊实验等技术，验证、确定GTTin/out蛋白结构特征，解析跨膜转运机制；利用转录组学、硫代谢图谱等方法，明确硫跨膜转运在硫代谢调控过程中的关键作用。通过项目的开展，阐明硫碱弧菌聚硫化物跨膜转运机制及其调控硫代谢功能，进一步完善微生物硫代谢基础理论，指导含H2S气体的生物脱硫过程。

生物脱硫技术具有工艺简单、反应条件温和、H2S去除率高、无二次污染等优点，在中小处理规模时，生物脱硫技术具有明显成本优势。在生物脱硫过程中，聚硫化物的跨膜转运是影响脱硫效率的关键。本项目借助现代分子生物学技术、组学手段等，获得了一系列有关硫碱弧菌D301硫跨膜转运及硫代谢的重要结果和关键数据。①优化了基于CRISPR的硫碱弧菌D301基因编辑方法。首次建立了适合硫碱弧菌的电转化方法，电转化效率提高至5.0×104 transformants/μg DNA。其次，建立了硫碱弧菌CRISPR/AsCpf1基因组编辑系统，成功地实现了对硫碱弧菌的基因组编辑，包括单基因敲除、大片段基因删除（17 kb）和多位点基因敲除。②基因fccAB的体外表达及硫氧化产物分析。以pBBR1MCS质粒作为出发质粒，构建抗性筛选和红色荧光蛋白的两种探针。对比lac、T3启动子，确定tac启动子比p3更有效。在生物硫氧化反应器中进行硫氧化实验及硫氧化产物分析，确定形成长链的聚硫化物（HSn-，n=2-4）。③硫跨膜转运蛋白基因的敲除及对硫代谢的影响。研究发现rhd和tusA的缺失分别使得菌体OD600值提高了38.3%和32.8%。Rhd蛋白的缺失促使细胞单质硫产量提高了8%。敲除rhd和tusA后，硫氧化表型与rhd缺失菌株硫氧化表型一致，说明rhd是硫转运过程中的首要蛋白。soxL的敲除对 T.versutus D301的生长和硫代硫酸盐氧化有显著地抑制作用，这表明soxL是硫碱弧菌硫代硫酸盐氧化过程中重要的硫转运蛋白。④转录组解析硫代谢途径。比较不同硫源培养下 T.versutus D301的生长代谢、硫代谢相关基因的转录情况，发现以硫代硫酸盐为硫源时，T.versutus D301的生长速率和硫氧化活性较高。在周质中，硫代硫酸盐和化学硫磺生成的多硫化物通过类似截短的Sox体系(SoxAXYZB)氧化成硫酸盐。此外，部分多硫化物通过类似Dsr体系在细胞质内被氧化成亚硫酸盐，亚硫酸盐被SoxB或SoeABC进一步氧化成硫酸盐。通过本项目的开展进一步完善了人们对硫碱弧菌硫化物代谢过程的认知，同时，为解决硫过氧化问题提供理论支持。