庆大霉素C2和C2a异构体形成机制及其应用研究

Gentamicin produced by Micromonospora echinospora comprises four major compounds, that is, gentamicin C1, C1a, C2, and C2a. C2 and C2a are epimers with the same bactericidal efficacy while C2 exhibits no nephrotoxicity and little cellular toxicity. GenB1 and GenB2 are pyridoxal phosphate (PLP) -linked aminotransferases with different substrate specificity and enantioselectivity. GenB2 is also an epimerase and catalyzed the epimerization of C2a/C2. Firstly, the activity center of GenB1 and GenB2 transaminase will be determined by Site-directed mutagenesis and the catalytic mechanisms will be detected. Secondly, this project is aim to clearly illustrate that the epimerization of gentamicin C2 to gentamicin C2a. Thirdly,GenB2* mutant that inactivation of epimerase but continue to have aminotransferase activity can be used for creating genetically engineered strain that overproduces low toxicity gentamicin C2. This study will determine the biosynthetic pathways of different gentamicin factors, and will lay foundation for combinatorial biosynthesis of low toxicity gentamicin.

庆大霉素由棘孢小单孢菌（Micromonospora echinospora）产生，包含四个主要组分C1、C1a、C2和C2a，其中C2和C2a为一对C-6’差向异构体，它们具有相同的抑菌活性但C2却表现为无肾毒性和低细胞毒性。棘孢小单孢菌中庆大霉素生物合成基因簇中GenB1和GenB2为磷酸吡哆醛依赖的氨基转移酶，两者具有不同的底物特异性和对映选择性。GenB2为双功能酶，同时具有异构酶活性，催化C2a/C2的异构化反应。本研究课题将通过定点突变技术确定GenB1和GenB2转氨酶活性中心并研究催化机理，从而揭示为什么二者底物特异性和构型选择性不同；阐明GenB2异构酶功能的分子机理，并利用改造后仅保留氨基转移酶活性而失活其异构酶活性的GenB2*，通过组合生物合成技术获得低毒性的庆大霉素C2高产的基因工程菌株。本项目将为全面阐明庆大霉素生物合成机制和研制低毒庆大霉素奠定基础。

本项目对庆大霉素四个主要组分C1、C1a、C2、C2a中的C2和C2a差向异构体形成机制进行了研究。同时扩展对C-3′,4′-双脱氧过程进行了研究，为全面阐明庆大霉素生物合成机制和研制低毒庆大霉素奠定基础。.本项目研究了GenB2活性位点并对其进行改造、推测其差向异构化机理。同时研究了庆大霉素C-3’,C-4’双脱氧过程。.研究证明GenB2只能催化JI-20Ba/JI-20B和庆大霉素C2/C2a之间差向异构化，不能催化磷酸化JI-20Ba/JI-20B、威大霉素C2/C2a、VF3-1/VF3-1a等异构体差向异构。通过点突变证明GenB2催化的转氨反应和差向异构反应是两个独立的反应。突变体GenB2-Q340N和GenB2-E336A不能催化庆大霉素C2差向异构化为庆大霉素C2a，催化庆大霉素C2a差向异构化为C2的活性降低。证明GenP为磷酸转移酶，催化庆大霉素生物合成途径中C-3’磷酸化，磷酸化产物为GenB3催化的双脱氧的底物。GenB3为PLP依赖性酶，既可以催化氨基转移反应，也可以催化脱磷酸和脱水反应。在C-3’,C-4’双脱氧过程中，GenB3催化磷酸化底物的C-3’脱磷酸，以及C-4’,C-5’的脱水反应。GenB4为烯基还原-转氨双功能酶，负责催化C4’,C5’双键还原和转氨基。在C-3’,4’-双脱氧过程过程中，GenB1催化形成S型，GenB2催化形成R型。.利用双脱氧酶系GenP-GenB3-GenB4体外催化kanamycin B生成dibekacin。首次生物合成dibekacin并提出其生物合成途径，具有重要的实际应用价值。