采用组合生物合成策略定向合成庆大霉素B的研究

Gentamicin B is the important precursor for synthesis of isepamicin, which is widely used in moderate and severe degree infection. But the production of gentamicin B is very low in its producing strain Micromonospora purpurea. In addition, because gentamicin B producer not only produce gentamicin B, but also produce gentamicin C1a, gentamicin C2, gentamicin C2b and gentamicin C1, the purification process of gentamicin B is complex and the productivity of gentamicin B is low. In this work, genes involved in 3',4' deoxygenation of gentamicin biosynthesis will be studied because the deoxygenation structure is the main difference between gentamicin B and gentamicin C complex. Furthermore, to study gentamicin B biosynthetic pathway and change the metabolic flux into gentamicin B biosynthesis, the foreign kanamycin biosynthetic genes KanJ and KanK will be expressed in Micromonospora purpurea, which encode enzymes transforming 2,6-diamino-glucose into 6-glucosamine. This study will determine the biosynthetic pathways of different gentamicin factors, and will lay foundation for combinatorial biosynthesis of target product gentamicin B.

庆大霉素B是异帕米星需要为合成前体，异帕米星对细菌产生的多数氨基糖甙类钝化酶稳定，是中重度感染首选联合用药。由于庆大霉素产生菌可以生物合成C1、C1a、C2、C2a、庆大霉素B等多种组分，所以目前生产庆大霉素B的菌株产量较低，组分较多，后续分离提取工艺复杂、产量低。本项目通过对小单胞菌中庆大霉素生物合成途径中的3',4'-脱羟基酶基因和不同代谢途径基因的研究，确定庆大霉素生物合成途径中相关基因的功能。将卡那霉素生物合成途径中将2,6-二氨基葡萄糖转变为6-氨基葡萄糖的基因KanK\KanJ重组到庆大霉素生物合成基因组中，探讨了不同氨基糖苷类抗生素基因组合，改变其代谢途径，形成新的生物合成途径，产生新化合物庆大霉素B的机制。揭示小单胞菌产生的庆大霉素不同组分的生物合成规律，为庆大霉素生物合成途径的遗传改良奠定基础，为利用组合生物合成技术获得特定的化合物提供理论依据。

庆大霉素B是异帕米星合成的前体，异帕米星对多种氨基糖苷类抗生素钝化酶稳定，是中重度感染首选联合用药。但由于庆大霉素B产生菌同时产生庆大霉素C1a、C2、C2a、C1等多种组分，目前庆大霉素B产量较低，组分多，分离纯化复杂，生产成本高。因此本课题在阐明关键基因功能的基础上，通过组合生物合成方法构建不产生庆大霉素C1a、C2、C2a、C1等多种杂质组分，而庆大霉素B高产的菌株。.本项目首先通过对庆大霉素生物合成途径中的脱氧酶基因等相关基因进行研究，使用同源双交换方法敲除genP基因，构建获得庆大霉素B合成前体JI-20A高产菌株。接着将卡那霉素生物合成途径中催化C2’氨基转变为C-2’羟基的酶KanJ和KanK的基因克隆入JI-20A产生菌中进行表达，获得了不产生庆大霉素C1a、C2、C2a、C1等多种杂质组分而产生庆大霉素B的菌株，但庆大霉素产量低。项目接着通过优化启动子强度、基因在基因组中的整合方式、以及优化培养条件，最终获得了庆大霉素B产量≈900μg/ml的高产菌株，比原始菌株产量提高了23倍，且不再产生庆大霉素C1a、C2、C2a、C1等多种杂质组分，适于工业化生产庆大霉素B。.本课题在阐明庆大霉素和卡那霉素生物合成关键途径的基础上，探讨不同氨基糖苷类抗生素基因组合，以改变原菌株代谢流，设计新的庆大霉素B合成代谢途径。解释小单孢菌产生庆大霉素不同组分的生物合成规律，为庆大霉素生物合成途径的遗传改良奠定基础，为探索组合生物合成技术获得特定目标化合物建立科学方法。