聚阳离子包衣纳米粒疫苗诱导树突细胞交叉递呈的体内外研究

Cross-presentation is the key process in stimulation of cytotoxic T lymphocyte (CTL) immune response in eliminating many infectious diseases and tumors. The traditional vaccine can only induces humoral immune response to prevent diseases other than eliminating infectious diseases and tumors. Biodegradable and biocompatibility polymer poly(D,L-lactic-co-glycolic acid)(PLGA) functions as antigen delivery system. Our previous studies have shown that surface modification of PLGA particles with polycations (protamine, chitosan and N-trimethyl chitosan) enhanced their adjuvant ability resulting in a strong antibody response to the encapsulated antigen. Our previous study showed polycations coated PLGA nanoparticles enhanced cross-presentation of encapsulated antigen in dendritic cells, which suggested the possibility to be the therapy vaccine. However, the mechanism of cross-presentation by polycations coated PLGA nanoparticles has not been addressed yet. In this study, the cationic modifications and PLGA will be marked and prepared nanoparticles. The fate of nanoparticles in endosome or cytoplasm after bing uptake by dendritic cells will be observed in vitro. And the antigen uptaken by antigen presentation cells and shift to local lymphy code will be ovsered in vivo. The results will be discussed as mechanism, and it will provide experimental evidence to be a potent nano-drug delivery system for cellular vaccines for tumur and infected deseases.

交叉递呈是外源性抗原激发细胞毒T淋巴细胞反应，清除感染疾病及肿瘤的关键步骤，但传统的疫苗仅诱导体液免疫反应以预防疾病而难以清除已发生的感染性疾病及肿瘤。高分子材料聚乳酸羟基乙酸（PLGA）具有良好的生物相容性和生物可降解性。研究表明PLGA纳米粒表面修饰以带不同电荷可增加载体的佐剂效应诱导细胞免疫反应。我们前期研究发现以鱼精蛋白、壳聚糖及N-三甲基壳聚糖为代表的聚阳离子包衣的PLGA纳米粒具有增强包载抗原在树突细胞内的交叉递呈的现象，提示其可以作为治疗性疫苗，但其诱导交叉递呈的具体机制尚未明了。本研究拟采用荧光同时标记阳离子修饰物及PLGA并制备纳米粒，体外实验观测其经树突细胞吞噬后在溶酶体及胞质内的转归；体内实验观测其经接种局部抗原递呈细胞吞噬并移行至淋巴结后的动态变化，以探讨其增强抗原交叉递呈的机制，为制备肿瘤及感染性疾病的新型治疗性疫苗纳米载药系统提供实验依据。

抗原递呈细胞对外源性抗原的交叉递呈在激发机体抗肿瘤及抗胞内菌感染（如艾滋病、疟疾等）中发挥了重要作用。本研究中，我们主要研究了PLGA/PS纳米粒、纳米富勒烯衍生化物纳米粒（羟基化衍生物C60-OH及羧基化衍生物C60-COOH）对抗原递呈细胞（巨噬细胞和树突状细胞）的免疫调节机制，以期发现更好的疫苗纳米载体。本研究将这些纳米粒与小鼠髓系树突细胞（BMDC）或小鼠巨噬细胞系细胞（RAW264.7）相互作用，分别观察两种抗原递呈细胞对纳米粒的摄取、细胞因子水平、相关的表面分子（MHCI、MHC II等）表达，交叉递呈作用及其与巨噬细胞极化相关的mRNA表达及纳米粒摄取后在亚细胞器的分布。结果表明，BMDC、RAW264.7对C60-COOH NPs的摄取明显优于PLGA/PS NPs和C60-OH NPs，且这种作用具有时间依赖性。三种纳米粒可显著促进BMDC对B3Z T细胞的交叉递呈作用，此外还能促进BMDC分泌促Th1反应的细胞因子IL12p70。在细胞因子水平实验里，我们发现C60-OH NPs和C60-COOH NPs能够增强LPS诱导的巨噬细胞M1极化作用，具有促进炎症的作用。而在mRNA水平的研究上，我们的研究发现C60-COOH NPs组在LPS和IL4诱导下均能显著增高iNOS、IL-12、IL-10、Arg-1基因的mRNA表达，提示具有同时促进RAW264.7细胞向M1型和M2型转化的作用。电镜观察发现C60-COOH NPs可能具有破坏溶酶体的作用。通过以上研究发现，C60-COOH NPs具有较好的促进抗原递呈细胞吞噬、促进抗原递呈细胞成熟及炎性反应作用，并可增强BMDC对外源性抗原的交叉递呈作用，为其作为新型疫苗载药体系提供了研究基础。