大肠杆菌维生素B12好氧合成途径的构建及优化表达调控

Vitamin B12 (VB12) is an important kind of corrin compound. Currently, the developed aerobic fermentation process based on P. denitrificans has become the mainstream for VB12 production. However, to date, no research about gene expression and regulation of aerobic VB12 synthetic pathway was reported. At present, the genetic tools developed for operation in P. denitrificans were very limited, which further restricted study of the related metabolism. Along with the development of biotechnology, Escherichia coli, because of its many advantages, such as rich genetic tools developed, has been widely used in gene expression analysis and metabolic engineering for several medicine compound and industrial material production. Based on previous study on regulation and optimization of 5-aminolevulinic acid synthesis, we will construct the aerobic VB12 synthesis pathway in E. coli through gene assembly and genomic integration. By systematically analyzing the level of gene expression and intermediary metabolite, we will resolve the critical gene and the control note of the pathway. Meanwhile, we will also analyze the effect of optimized expression of the key enzyme on VB12 synthesis by means of several strategies. The results obtained will give a meaningful aid for constructing good characterized strain for VB12 microbial production.

维生素B12（VB12）是一种重要的咕啉类化合物。目前，基于脱氮假单胞菌开发的好氧发酵工艺已成为国内外工业化生产VB12的主流。然而关于VB12好氧合成途径基因表达调控方面的研究尚无报道。基于脱氮假单胞菌菌株所开发的遗传工具甚少，从而限制了其代谢调控的相关研究。随着生物技术的发展，大肠杆菌由于其遗传工具丰富等诸多优点，已经广泛应用于基因表达调控以及各种医药化合物及化工原料合成的代谢工程研究。本项目将在大肠杆菌5-氨基乙酰丙酸合成途径调控研究的基础上，通过基因组装以及基因组整合在大肠杆菌内构建VB12好氧合成途径，进而系统分析VB12好氧合成途径的基因表达及其中间代谢产物，以解析关键基因及其调控节点。同时，通过多种策略分析各关键基因的优化表达对 VB12合成的影响。该研究结果将为构建高产VB12的工程菌株提供重要的指导作用。

维生素B12（Vitamin B12, VB12），又称钴胺素，是一类含有钴的咕啉类化合物的总称，其主要生理功能是参与制造骨髓红细胞，防止恶性贫血和大脑神经受到破坏。目前已广泛应用于饲料、食品、医药和化妆品等领域。由于化学合成步骤多，收率极低，工业生产VB12主要采用微生物发酵法，生产菌株主要是谢氏丙酸杆菌和脱氮假单胞菌。由于这两株菌培养条件及生理特征的限制，目前很难通过代谢改造及调控进一步提高VB12的产量。.大肠杆菌中，基因组测序表明VB12的合成途径不完整，鉴于大肠杆菌在分子操作方面的优点，针对缺失基因，通过基因组装优化，在大肠杆菌中表达来源于类球红细菌及恶臭假单胞菌维生素B12合成途径的基因，在大肠杆菌中构建VB12的好氧合成途径。通过HPLC及质谱分析，检测到了VB12，产量约为100 μg/L，实现了大肠杆菌好氧条件下合成VB12。.同时对VB12关键前体5-氨基乙酰丙酸（ALA）的合成进行分析，过量表达血红素合成途径基因时，过量表达hemD和hemF，促进ALA的积累，表达hemB、hemG和hemH，ALA产量下降，而表达基因hemC和hemE对ALA的合成没有明显影响。使用不同质粒分析了关键基因hemA、hemL、hemD和hemF的表达水平对ALA合成的影响，重组菌LADF-6在3 L发酵罐中放大培养ALA产量为3.25 g/L，是对照菌株的1.79倍。在转录水平和蛋白水平分析初步证明中间产物原卟啉原IX对ALA脱水酶有反馈抑制。通过表达基因hemA、hemL、hemD和hemF及在培养基中优化血红素关键组分Fe2+的添加量，实现了ALA产量及细胞生长的进一步提高，重组菌LADF-6在3 L发酵罐中培养ALA产量为4.05 g/L。.对ALA上游关键基因hemA和hemL的RBS构建突变库，经高通量筛选及不同RBS强度组合优化，摇瓶水平ALA产量为2.41 g/L。采用不同方式对ALA脱水酶的表达水平进行调控，将基因组中hemB启动子替换为fliC基因启动子时，摇瓶水平ALA产量为2.68 g/L，比对照菌提高了11.1%。.最后，对厌氧条件合成VB12的罗伊氏乳杆菌和巨大芽孢杆菌合成VB12的发酵条件进行优化，经质谱验证有活性的VB12合成，罗伊氏乳杆菌中产量为44.6 μg/L，巨大芽孢杆菌中产量为204.5 μg/L，是对照菌的750倍。