糖胺聚糖及其寡聚糖的微生物合成与分子量调控机制研究

Hyaluronan, heparin and chondroitin sulfate as the main three types of glycosaminoglycans (GAG) have been widely used in medicine and other fields, however, due to the unclear regulation mechanisms of biosynthesis and molecular weight, it is still a big challenge to construct microbial cell factories to produce specific molecular weight GAG with desired biological functions. Based on our previous studies, we will identify specific functional domains of the glycosyl transferases and resolve the regulation mechanism of the biosynthesis, secretion and molecular weight through dynamic and rational regulation of the precursors biosynthesis pathways, function domain exchange and molecular engineering of the glycosyl transferases. Then an efficient in vitro sulfating modification system will be established by secretory expression, optimization and assembly of the sulfating modification system components. In addition, mutants that can hydrolyze heparin and chondroitin sulfate will be created by rapidly engineering the leech hyaluronidase (LHAase). On this basis, the crystal structure and hydrolysis mechanism of LHAase and its mutants will be resolved. Finally, we will construct the Bacillus subtilis microbial cell factories to directly produce hyaluronan, heparin, chondroitin sulfate, and its oligosaccharides with specific molecular weights.

透明质酸、肝素和硫酸软骨素作为主要的三类糖胺聚糖已广泛应用于医药等领域，然而，由于以上三类糖胺聚糖生物合成与分子量的调控机制尚不清楚，构建微生物细胞合成具有特定生物学功能的特定分子量的糖胺聚糖依然是一个挑战。本项目在前期研究的基础上，通过动态与理性调控三类糖胺聚糖的前体合成途径，结合糖基转移酶的功能域互换与分子改造，明确各糖基转移酶的功能域定位以及解析三类糖胺聚糖的合成分泌以及分子量调控机制；通过分泌表达与优化组装硫酸化修饰系统各组分，构建高效体外硫酸化修饰系统；通过快速进化水蛭透明质酸酶，获得水解肝素和硫酸软骨素的突变体，在此基础上，解析水蛭透明质酸酶和突变体晶体结构以及水解机制。整合以上研究，构建枯草芽孢杆菌微生物细胞工厂发酵葡萄糖等廉价碳源一步合成特定分子量的透明质酸、肝素和硫酸软骨素以及寡聚糖。

透明质酸、肝素和硫酸软骨素作为主要的三类糖胺聚糖（Glycosaminoglycan, GAG），由于其独特的分子结构和理化性质而拥有众多的生理功能，已广泛应用于医药、医美及食品等领域。然而，由于以上三类糖胺聚糖生物合成与分子量的调控机制尚不清楚，构建微生物细胞合成具有特定生物学功能的特定分子量的糖胺聚糖依然是一个挑战。.首先本项目在前期的研究基础上，在食品级宿主谷氨酸棒杆菌中打通了透明质酸合成途径并强化途径基因、削弱竞争途径，研究了发酵过程中透明质酸荚膜层的形成及其对传质及产量的影响，最终重组谷氨酸棒杆菌cgspH-7在5 L发酵罐中透明质酸产量达到74.1 g L-1。使用组成型启动子表达水蛭透明质酸酶（LHyal），通过组合策略进一步提高酶活，在3 L发酵罐流加甘油进行高密度培养重组菌株，LHyal酶活可达2.12×106 U mL-1。利用LHyal与牛睾丸型透明质酸酶（BTH）切割不同糖苷键的特性，共同降解大分子透明质酸（HA）用于制备不同聚合度的HA偶数与奇数寡糖。.解析软骨素的合成途径，构建枯草芽孢杆菌微生物细胞工厂，发酵葡萄糖一步合成特定分子量的软骨素。进一步在大肠杆菌中表达鼠源酰基磺酸转移酶ASST IV构建PAPS再生系统，同时表达动物源硫酸软骨素磺基转移酶构建磺酸化修饰系统。在此基础上，整合并优化PAPS再生系统及磺酸化修饰系统，得到了特定构型的硫酸软骨素A和硫酸软骨素C，并对反应体系进行优化，硫酸软骨素A的转化率可达98％。同时表达硫酸软骨素裂解酶ABC I用于体外调控硫酸软骨素分子量，通过优化酶的表达和性能获得催化效率与酶活同时提高的突变体NΔ5/E694P，在3 L发酵罐分批发酵重组菌株，酶活达到1.0×105 U L-1。.通过基因组装优化构建肝素前体的合成途径，获得一株重组枯草芽孢杆菌，3 L发酵罐中肝素前体产量达到7.25 g L-1。肝素经动物源磺基转移酶及差向异构酶修饰，抗凝血活性提高了148%，达到189.17 IU mg-1。筛选不同来源的肝素裂解酶，通过理性设计和半理性设计提高肝素裂解酶的催化性能，在3 L发酵罐放大培养最优的重组菌株，突变体E105R/S264F的酶活达到2.9×10 4 U L-1。