维生素B12需氧合成关键酶CobG对脱氮假单胞杆菌异常氧代谢的调控机制研究

VB12是用以治疗恶性贫血症的重要活性物质,其需氧合成途径涉及单加氧酶CobG酶所催化的氧原子插入反应,而CobG酶需要分子氧的激活。本课题组前期研究发现，VB12好氧产生菌脱氮假单胞杆菌发酵过程中对氧表现出异常高的亲和力，与其它好氧菌株的氧消耗动力学特征有着根本差异。基于此，本项目以关键酶CobG为研究对象，考察CobG酶对脱氮假单胞杆菌异常氧代谢的调控机制：（1）在建立单级恒化器连续培养方式基础上，探索溶氧浓度变化下脱氮假单胞杆菌代谢途径变化的连锁机制，尤其关注CobG酶酶活的时序性动态变化；（2）在重组菌E. coli BL21(DE3)/pET14b-CobG中诱导表达脱氮假单胞杆菌中的CobG酶，通过生物转化和体外酶动力学研究，探索CobG酶与分子氧的亲和关系。本研究旨在从理论上阐释CobG酶对脱氮假单胞杆菌异常氧代谢的调控机制，为VB12工业化发酵工艺的优化提供新的思路和方法。

维生素B12 是用以治疗恶性贫血症的类咕啉化合物，其生物合成存在两种不同的合成途径，即需氧途径与厌氧途径。本项目以维生素B12需氧合成途径的关键酶单加氧酶 CobG 酶为研究切入点，对其在脱氮假单胞杆菌中的氧调控机制进行了详细研究，并基于发酵过程的供氧差异调节，进一步阐明了不同供氧水平下脱氮假单胞杆菌的代谢特征。. （1）首先借助单级恒化器连续培养模式，探索到了分子氧对脱氮假单胞杆菌代谢途径的连锁作用机制。结果表明：供氧程度的提高（将发酵液的溶氧由20%提高并控制在40%左右）可明显激活CobG酶的酶活力；此外，不仅会显著降低EMP途径的代谢流并提高HMP和TCA途径的通量，而且还会明显降低维生素B12合成途径的关键酶ALA合酶和PBG合酶的酶活力，从而对维生素B12合成产生负作用。. （2）通过重组菌E. coli BL21(DE3)/pET14b-CobG诱导表达CobG酶，利用生物转化合成法和体外酶动力学研究的方法，探索到了CobG酶与分子氧的亲和关系，即CobG酶可通过其酶促反应对分子氧表现出高度的亲和力。此结论表明了脱氮假单胞杆菌在高供氧状况（溶氧达30%以上）下提高搅拌转速致使OUR在短时间内剧烈升高，并非因发酵供氧和菌体呼吸改变而造成的，而应归结为供氧水平提高所激发的CobG酶催化效率。. （3）利用气相色谱-质谱连用（GC-MS）技术，研究了不同供氧条件下脱氮假单胞菌杆菌胞内代谢物的代谢组学，结果表明供氧水平的改变会对脱氮假单胞杆菌发酵过程中的脂肪酸代谢以及糖代谢途径产生较大的影响。进一步基于发酵过程的供氧差异调节，阐明了脱氮假单胞杆菌高产维生素B12的典型代谢特征，结果表明维生素B12高产的共同代谢特征是EMP途径的代谢通量相对较强，而HMP途径的代谢流则要相对较弱。. 本项目已为基于氧调控的维生素B12工业化发酵工艺优化提供了重要理论指导，相关成果在国内外学术刊物上发表论文6篇（其中SCI论文3篇），做学术会议大会报告2次，完成硕士学位论文2篇。