大肠杆菌D-苯丙氨酸生物合成途径的构建及优化

D-phenylalanine is a high value-added non-natural amino acid , which is widely used in the field of medicine, food, etc. But it still can not be directly produced by fermentation at home and abroad. Escherichia coli, as a commonly used strain in the industrial fermentation, is not able to synthesize D-phenylalanine. Therefore, constructing complete D-phenylalanine biosynthetic pathway in E. coli and exploring the possibility of D-phenylalanine fermentation production with glucose are of great significance. To build the synthesis pathway of D-phenylalanine, E. coli will be modified genetically. The heterologous D-aminotransferase gene is transformed into E. coli to construct D-phenylalanine biosynthetic pathway. .Enzymes activities and intermediate metabolite concentrations involved in this biosynthetic pathway will be analyzed to determine the metabolic bottleneck. Then, using molecular biological methods, the regulation mechanism of D-phenylalanine biosynthesis is illustrated by the ways as followed: enhancing D-phenylalanine efflux capacity, regulating promoters to control expression of genes related with D-phenylalanine biosynthesis and modifying the key enzymes in specific activity and substrate specificity. On this base，we aim to optimize the D-phenylalanine biosynthesis pathway and make E. coli be able to sysnthsize D-phenylalanine. This project provides a theoretical basis and practical experience for genetics and breeding of industrial microbes in fermentation production of D-phenylalanine, other D-amino acids and their derivatives.

D-苯丙氨酸是一种高附加值非天然氨基酸，在医药、食品等领域广泛应用，但目前国内外仍无法实现D-苯丙氨酸的直接发酵法生产。氨基酸工业生产中的常用菌株大肠杆菌不能合成D-苯丙氨酸，因此，构建完整的大肠杆菌D-苯丙氨酸生物合成途径并探讨其利用葡萄糖为原料实现直接发酵生产具有重要的意义。本项目以构建D-苯丙氨酸合成途径为目标,对大肠杆菌进行系统的研究和改造。将外源的D-氨基转移酶基因转入大肠杆菌，构建D-苯丙氨酸生物合成途径，分析D-苯丙氨酸合成代谢的瓶颈；通过增强细胞D-苯丙氨酸外排能力、调节代谢通路中控制基因表达的启动子及改造关键酶或限速酶的比活力或底物特异性等方法阐明D-苯丙氨酸生物合成的调控机制。在此基础上，优化D-苯丙氨酸合成代谢途径，实现D-苯丙氨酸在大肠杆菌中的生物合成。本项目的研究将为利用葡萄糖发酵生产D-苯丙氨酸和其他D型氨基酸及衍生物的工业微生物遗传育种提供理论基础和实践经验。

D-苯丙氨酸作为药物中间体在医药领域的市场空间、应用价值越来越大。传统的手性拆分方法导致D-苯丙氨酸生产成本过高，已无法满足医药领域对 D-苯丙氨酸低成本高纯度的要求。能够直接合成D-苯丙氨酸的菌株存在遗传操作困难、D-苯丙氨酸合成途径中的酶活性低等缺点，导致目前尚无法实现D-苯丙氨酸的直接发酵生产。本项目按照研究计划完成了大肠杆菌D -苯丙氨酸合成途径构建及优化工作。在构建的D-苯丙氨酸的底盘细胞的基础上，过表达PheAfbr和AroF，增加苯丙氨酸代谢途径通量，克隆来源于枯草芽胞杆菌的D-氨基酸转移酶，构建D-苯丙氨酸合成模块，D-苯丙氨酸的积累量达到84 mg/L；进一步通过增加表达质粒的稳定性、敲除转录调控蛋白tyrR基因和敲除丙酮酸激酶pykF基因的组合策略，增加L-苯丙氨酸合成途径代谢通量，L-苯丙氨酸积累量达到18.2 g/L；分析比较了来源于不同菌株的4种D-氨基酸转氨酶，获得了高活性的来源于变形赖氨酸芽胞杆菌的D-氨基转移酶DatLv；在底盘菌中成功引入来源于变形赖氨酸芽胞杆菌的D-氨基转移酶，D-苯丙氨酸的积累量达到1.1 g/L；在此基础上过表达丙氨酸消旋酶（dadX）和丙氨酸脱氢酶（ald），增强了前体D-丙氨酸的供应，所构建的工程菌在 7.5-L 小试发酵水平，D-苯丙氨酸最高产量达到2.8 g/L，该产量是目前不添加前体物的直接发酵法产D-苯丙氨酸的文献报道最高水平。大肠杆菌D-苯丙氨酸生物合成途径的构建及优化为其它D-型氨基酸和手性化合物的直接发酵法合成提供了实践基础。