陆生蓝藻发菜响应干旱胁迫的蛋白质磷酸化分子调控机制研究

Nostoc flagelliforme is a kind of terrestrial nitrogen-fixing cyanobacterium being strong drought ecological adaptability. The research is aimed at studying theoretically and practically significant drought-resistant molecular mechanism of N. flagelliforme. The phosphoproteomics based on iTRAQ, qRT-PCR, Western-blotting, plant physiology related technologies, gene cloning techniques and bioinformatics methods will be employed to compare the changes of phosphoproteins and their phosphorylation sites, to analyse protein phosphorylation molecular regulatory mechanism with the study results of the important protein phosphorylation modification and physiological metabolism of the important metabolic pathways and signaling pathway for N. flagelliforme in response to drought stress. In addition, full length of some important phosphoprotein genes will be coloned, and function will be also studied. The research will be of a great significance for understanding molecular mechanism of drought-tolerance in N. flagelliforme and its evolutionary mechanism, will provide a reference for terrestrial cyanobacteria or higher plants in response to drought stress, and will lay a foundation for molecular basis and gene resources of drought tolerance on plant breeding, particularly in corps.

发菜是一种分布在荒漠―半荒漠草原地区的陆生蓝藻，对干旱胁迫具有极强的适应性。针对在理论和实践上有重要意义的发菜耐旱分子调控机理开展研究。本研究运用基于iTRAQ的磷酸化蛋白质组学技术、qRT-PCR、Western-blotting、基因克隆技术和生物信息学方法等分析、鉴定、识别发菜响应干旱胁迫的磷酸化蛋白及其磷酸化作用位点，分析重要蛋白质磷酸化修饰及调控的代谢路径或信号通路代谢产物的变化，解析发菜响应干旱胁迫的磷酸化分子调控机制，克隆重要调控网络或信号通路的关键调节基因并分析其功能。本研究对于阐明发菜耐旱分子机理及进化机制具有重要的理论意义，并为陆生蓝藻或高等植物耐旱机理的研究提供参考与理论依据，同时为培育耐旱植物（尤其是农作物）提供分子生物学基础和基因资源。

发菜是一种分布在荒漠―半荒漠草原地区的陆生蓝藻，对干旱胁迫具有极强的适应性。针对在理论和实践上有重要意义的发菜耐旱分子调控机理开展研究。获得了以下研究结果：.（1）对发菜在干旱胁迫下的蛋白质表达进行检测，共鉴定到1617 个蛋白质，有差异蛋白351个，主要涉及光合作用、糖和能量代谢、蛋白质合成和降解以及抗氧化等生物学过程。在核糖体代谢、光合作用、碳固定、磷酸戊糖途径、淀粉和蔗糖代谢等重要通路发生了显著变化.（2）建立了基于iTRAQ的干旱胁迫下发菜磷酸化蛋白质组学研究的技术方案，共鉴定到756 个磷酸化蛋白质，干旱胁迫条件下磷酸化差异肽段为60 个，对应的蛋白质为 48 个，上调磷酸化肽段一共有26个，下调磷酸化肽段有60个。......S.E....五种motif在磷酸化位点中显著保守。KEGG 通路富集分析表明，Photosynthesis- antenna proteins 重要通路发生了显著变化。.（3）随着干旱胁迫程度的增加，发菜中petC、cpcE、atpG、Ccmk、RPIA、Prx、Trx、和BVR 等基因在转录水平表达量逐渐下降，SS表达量逐渐上升，apcB、rbcs、SOD和GlgC基因先下降后上升的趋势，petH、atpH、PGK、FBP基因先上升后下降的趋势，PGD、GlgA、glk基因先下降后上升又下降，GST基因上升后下降又上升。.（4）随着干旱胁迫程度的加深，发菜SS、GlgA、PGD、CAT、GST和GR活性呈现出上升趋势，SOD和POD活性呈现逐渐下降趋势；发菜海藻糖、蔗糖、果糖、可溶性糖以及还原型谷胱甘肽含量均呈现出逐渐增加的趋势。.（5）构建了发菜干旱胁迫条件下蛋白质磷酸化调控网络图。.（6）克隆了干旱胁迫条件下发菜差异表达的磷酸化蛋白基因gnd、gst、proA、glmM、NfHK2并进行了生物信息学分析，将gnd、gst、proA、glmM、NfHK2基因在大肠杆菌中表达，获得预期大小的重组蛋白。构建了发菜gst真核表达表达载体，亚细胞定位表明GST蛋白是典型的细胞质蛋白。转gst拟南芥植株生长正常，T2成活率达到98%。.本研究对于阐明发菜耐旱分子机理及进化机制具有重要意义，为陆生蓝藻或高等植物耐旱机理研究提供参考，并为耐旱植物育种提供了分子生物学基础和基因资源。