发菜响应干旱胁迫的蛋白乙酰化修饰调控机制研究

Nostoc flagelliforme, a terrestrial cyanobacterium gorwing in an extreme environment, has a strong ability to adapt the stress environment. Nostoc flagelliforme is not only the pioneer plant in drought and desertification areas, but also an ideal species for studying drought-tolerant mechanism of plant and finding drought-tolerant genes. This project will investigate the differential acetylated proteins in abundance and the site of acetyl-modification in Nostoc flagelliforme under drought stress based on Label free analysis. The key proteins that regulate the drought tolerance of Nostoc flagelliforme will be screened and annotated by GO and KEGG Pathway enrichment analysis. To screen the acetylated proteins in response to drought stress and its motif, we will investigate the motif of protein acetylation, GO and KEGG Pathway enrichment analysis of the key acetylated proteins. In addition, the confocal laser scanning microscopy will be employed to identify the subcellular localization of acetylated protein. At the same time, the activity of key enzyme and the substances of the center metabolisms related to drought tolerance will be determined. Achievement of this project will reveal the drought-tolerant mechanism of Nostoc flagelliforme at the level of protein acetylation modification, and also make the advance in drought tolerance in higher plant. Furthermore, the achievement will provide the molecular biological basis for breeding drought-tolerant crops by using genetic engineering in future.

发菜是一种极端环境下生长的陆生蓝藻，对逆境具有极强的适应力，是干旱荒漠化地区的先锋植物，也是研究植物抗旱分子生理机制和挖掘耐旱基因的独特植物资源。因此，对其耐旱机制的研究在理论和实践上都具有重要意义。本项目采用Label free非标记定量蛋白组学技术，在全蛋白质组水平上对干旱胁迫下发菜蛋白乙酰化修饰位点及差异表达进行鉴定，并对乙酰化修饰位点及差异表达蛋白进行motif、GO和KEGG Pathway显著性富集分析，从中筛选出与耐旱密切相关的乙酰化修饰蛋白及蛋白质乙酰化修饰motif，并以此为主要切入点，采用激光共聚焦扫描显微技术对乙酰化蛋白进行亚细胞定位。同时对耐旱重要代谢通路中的关键酶活性及代谢产物含量进行分析。研究结果将从蛋白乙酰化修饰水平上揭示发菜耐旱的分子生理机制，同时对高等植物的抗旱性研究也起到积极的促进作用，为今后应用基因工程技术培育耐旱农作物品种提供分子生物学基础。

发菜是一种极端环境下生长的陆生蓝藻，对逆境具有极强的适应力，对其耐旱机制的研究在理论和实践上都具有重要意义。本项目采用Label free非标记定量蛋白组学技术，在全蛋白质组水平上对干旱胁迫下发菜蛋白乙酰化修饰位点及差异表达进行鉴定，从中筛选出与耐旱密切相关的乙酰化修饰蛋白及蛋白质乙酰化修饰motif，并在非靶向代谢组学水平上对发菜适应干旱胁迫的关键代谢物的变化规律进行分析。同时与蛋白质乙酰化修饰结果进行关联分析。筛选发菜耐旱关键基因并进行基因克隆及其功能分析。获得了以下研究结果：.（1）本项目共鉴定到乙酰化蛋白质1060个、乙酰化肽段2474个、乙酰化位点2523个。其中不同程度干旱胁迫处理中共有的乙酰化蛋白733个，乙酰化肽段1515个。在干旱胁迫6h、12h和48h处理下分别有134、226和338个差异乙酰化修饰蛋白，其中有55、54和27个蛋白上调表达，79、172和311个蛋白下调表达。功能分析显示，差异乙酰化修饰蛋白主要富集在谷胱甘肽代谢、能量代谢以及光合作用。.（2）蛋白乙酰化修饰与代谢物变化关联分析显示干旱胁迫下发菜蛋白质乙酰化修饰和代谢物主要富集在谷胱甘肽代谢途径中。.（3）对干旱胁迫条件下发菜差异基因Sus2和glgB进行了生物信息学分析。发菜Sus2基因全长312 bp (GenBank登录号：MG598619)，将Sus2基因进行原核表达，得到一个12.29 kD的外源蛋白。干旱胁迫下发菜Sus2在转录水平的表达量和蔗糖含量均逐渐增加。从发菜中克隆获得1,4-α-葡聚糖分支酶glgB基因全长2 292 bp (GenBank登录号: KX679395)，编码763个氨基酸。原核表达得到88.6 kD的glgB基因外源蛋白。发菜glgB在干旱胁迫下转录水平的表达量逐渐增加，GBE含量增加，糖原合成酶活性和糖原含量均先增加后降低。