发菜耐旱蛋白质分子网络解析及相关基因克隆与表达

发菜是一种天然耐旱陆生蓝藻，针对在理论和实践上有重要意义的发菜耐旱分子机理开展研究。采用双向电泳、Blue Native PAGE、质谱技术、FQ-PCR技术、western blot 技术和生物信息学手段，比较分析不同程度干旱胁迫下发菜藻体蛋白质组的差异变化，结合干旱胁迫下发菜重要生理学变化的分析，对差异蛋白表达模块进行分类，研究其与耐旱的相互关系，揭示发菜耐旱蛋白质功能网络，并克隆与发菜耐旱密切相关的基因，研究其原核和真核表达，分析其功能。本研究对于阐明发菜耐旱分子机理和进化机制具有重要理论意义，为陆生蓝藻或高等植物耐旱机理的研究提供参考，并为耐旱植物育种（尤其是农作物）提供分子生物学基础。

研究背景和方向：发菜是一种天然耐旱陆生蓝藻。针对在理论和实践上有重要意义的发菜耐旱分子机理开展了研究。.研究内容及重要结果：.1、干旱胁迫下发菜超微结构和生理变化.在干旱胁迫下，发菜藻体和细胞结构完整，无明显变化，但胶质鞘趋于紧密，液泡和糖原颗粒数目减少，MDA、超氧阴离子自由基含量等升高，可溶性蛋白、脯氨酸、叶绿素a、藻胆素含量、光合速率、呼吸速率等下降，H2O2、可溶性糖、类胡萝卜素含量和SOD、CAT、固氮酶、GS活性等先升高后下降。.2、干旱胁迫下发菜类囊体膜蛋白分离及鉴定.共分离和鉴定出8种发菜类囊体膜蛋白，根据其功能分为4类：光合代谢酶、结构域蛋白、碳水化合物选择蛋白、未知蛋白。它们在发菜的光合作用中具有重要作用。.3、干旱胁迫下差异蛋白质组学研究.干旱胁迫条件下发菜出现31个差异蛋白，其中4个呈上调表达，20个呈下调表达，7个呈波动变化。这些差异蛋白质主要参与抗氧化代谢、糖代谢、氮代谢、蛋白质合成途径。.4、干燥和复吸水发菜超微结构、生理和蛋白质组学分析.对持续失水然后恢复吸水条件下发菜的形态、结构及生理学特性进行了研究。与失水—复吸水密切相关的32 个差异蛋白被鉴定，包括分泌蛋白、信号转导、转录和翻译、抗氧化过程、氮代谢、碳和能量代谢、脂代谢、分子伴侣等蛋白。.5、差异蛋白基因克隆、表达及功能分析.克隆了peroxiredoxin基因（HM854286）、Mn-CAT基因（GU549477）和Ferritin基因（HM854287）并获得了相关生物学信息；将Mn-CAT、peroxiredoxin和Ferritin进行体外表达，分别获得一个约26.5 kD、26 kD和22.4 kD的外源蛋白。对Ferritin进行了真核表达和基因功能分析。.6、分子验证.Mn-CAT 和 peroxiredoxin 的Western blotting结果与2-DE及表达蛋白结果相符。RT-PCR分析表明，Mn-CAT、peroxiredoxin和Ferritin在转录和翻译水平上具有同样表达规律。.7、发菜耐旱蛋白质分子网络解析.初步构建了由胁迫与防卫、能量代谢、信号调控、分泌、氮代谢和未知蛋白等6大模块的发菜响应干旱的蛋白质分子网络，解释了发菜基于形态结构、生理和蛋白质组分的变化以适应干旱生态环境。.科学意义：本研究对于阐明发菜耐旱分子机理具有重要意义。