月季花提取物抗真菌活性的物质基础及作用机制研究

本课题组前期研究首次发现传月季花提取物对白念珠菌具有很强的体外活性和一定的动物体内活性，并且与氟康唑联合应用对耐药白念珠菌具有显著的协同作用；但是动物体内活性与其体外活性存在一定差异，有必要进一步分离、提取其活性组分，阐明其物质基础。经典的抗真菌药物作用机制和已知的抗白念珠菌药物靶点均不能成功解释月季花提取物抗真菌和抗耐药的作用机制，提示其可能通过未知的新靶点发挥作用。本项目拟利用传统的中药物质基础研究方法，结合现代中药血清药物化学技术，研究其抗真菌活性成分，初步阐明其物质基础；并进一步利用cDNA芯片、蛋白质二维电泳、GC/MS等现代药理学和药物分析学、分子生物学研究技术，考察月季花提取物活性组分对白念珠菌基因表达谱、蛋白表达谱和总代谢谱的影响，结合生物信息学分析，筛选发现可能的药物作用新靶点，为进一步开发月季花提取物活性组分及其他新型抗真菌药物奠定理论基础。

本课题组前期研究首次发现传月季花提取物对白念珠菌具有很强的体外活性和一定的动物体内活性，并且与氟康唑联合应用对耐药白念珠菌具有显著的协同作用；但是动物体内活性与其体外活性存在一定差异，有必要进一步分离、提取其活性组分，阐明其物质基础。本项目计划利用传统的中药物质基础研究方法，在分离纯化获得月季花的主要抗真菌有效成分成分后，再结合现代中药血清药物化学技术，验证其抗真菌活性成分，初步阐明其物质基础；并筛选发现可能的药物作用新靶点，为进一步开发月季花提取物活性组分及其他新型抗真菌药物奠定理论基础。.在本课题实际执行过程中，用传统的中药物质基础研究方法，并结合活性筛选跟踪，分离获得多个活性较好的协同抗耐药真菌活性部位：月季花提取物经聚酰胺吸附柱色谱分离和活性筛选发现80%甲醇部分活性较好，其FICI值为0.127；80%甲醇部分经硅胶吸附柱色谱分离得到了九个馏分: B1-B9，活性筛选发现B8和B9这两个馏分活性较好；B8通过凝胶吸附柱色谱分离后活性较好的馏分为C8-5、C8-6和C8-7，其中C8-7的活性最好，其对白念珠菌sc5314、Y0109、耐药菌103和100的FICI值分别为0.1289、0.2520、0.0156和0.0088；C8-5、C8-6和C8-7经反相硅胶吸附柱色谱后抗菌活性较好的部位为D8-7-1、D8-7-2和D8-7-3，活性较好的馏分的FICI值达到了0.0039；将活性较好的D8-7-1、D8-7-2和D8-7-3及B9经高效液相色谱制备分离共得9个化合物，其中D8-7-1E、D8-7-2E和B9- f1的协同氟康唑的作用较强，其FICI值可达到0.0022。经进一步分离纯化，确定了7个化合物单体的结构，其中没食子酸具有较好的协同抗耐药真菌活性。但由于没食子酸作用广泛，成药性不佳，本课题没有进一步研究其作用靶点，而是进一步分离纯化，以期获得其他有效新单体；同时用月季花总提物，初步考察了其对真菌细胞膜麦角甾醇生物合成的影响及与氟康唑的协同作用。发现月季花总提物可能通过在不同环节抑制真菌麦角甾醇生物合成而与氟康唑发挥协同抗真菌作用。同时，还建立了真菌胞内氟康唑含量测定方法，拟在后续的研究中考察月季花是否通过增加氟康唑的胞内浓度而发挥协同抗真菌作用。