家蝇抗真菌肽MAF-1抗真菌活性衍生肽的筛选和作用机制研究

Because of the increasing resistance of bacteria and fungi to available antibiotics, Construction designing and synthesis of small peptides from the information of structure-activity relationships of natural antibacterial peptides have become a new focus of developing small molecular peptide antibiotics that are safe, effective with low induction to drug-resistance. The housefly MAF-1 is an anti-fungus peptide newly found by us. Its amino acid sequence, functional domain, and action mode are different from those of reported antimicrobial peptides, showing a potential for development of new peptide antibiotics. A new small peptide of 26 amino acid residues derived from MAF-1 by us has shown activity of anti-fungus and drug-resistant strain of Candida albicans. This project is to investigate the effects of peptides derived from MAF-1 on C. albicans, and on the process of its mycelia becoming spores, and the molecular mechanisms, with molecular biology, chromatography, laser confocal microscope, electron microscope, uv spectrophotometer techniques. In the same time, the biological activities, active modes, physicochemical stability, enzyme-resistance, serum stability of MAF-1 derivatives and their toxicity to mammalian cells will be studied. The objective of the research is to screen a new scaffold type for development of high efficiency, and safe anti-fungus peptide medicine from MAF-1, and provide scientific bases for development of anti-fungus peptide medicine and research of innate immunologic mechanisms of insects.

通过天然抗菌肽结构与功能的研究，开发安全、有效、低毒的肽类抗生素，是寻找克服微生物耐药性重大难题新药源的非常重要的研究领域。MAF-1是本课题组发现的家蝇抗真菌肽分子。其氨基酸序列，功能结构域，抗真菌功能模式，均与已报道的抗菌肽不同，具备筛选新的有药物开发前景分子的潜能。所获得的首个MAF-1 26个氨基酸残基的新的衍生肽MAF-1A，对白假丝酵母菌及其耐药株具有良好的杀菌效果。本研究拟以MAF-1为模板，用分子生物学技术、色谱技术、激光共焦显微镜、电镜、紫外分光光度计等技术和方法，从细胞结构、遗传、代谢等细胞和分子水平，研究MAF-1系列衍生肽抗白假丝酵母菌，及其对菌丝相和孢子相转变干预的效果和分子机制，并分析衍生肽理化稳定性、体外酶稳定性，血清稳定性以及对哺乳动物细胞的毒性，筛选高效、安全的新型抗真菌肽类药物的分子模体，为肽类抗生素的开发和昆虫先天免疫机制的进一步研究提供科学基础。

1 研究背景：. 通过天然抗菌肽结构与功能的研究，开发安全、有效、低毒的小分子肽类抗生素功能模体，是寻找克服微生物耐药性重大难题新药源的非常重要的研究领域。项目开展了基于家蝇抗真菌肽MAF-1的抗真菌活性小分子功能模体筛选和作用机制研究的深入研究。..2 目的：.通过对家蝇独特抗真菌肽MAF-1的功能结构域和其点突变模体的体外抗真菌活性、稳定性、特异性、细胞毒性及抗真菌作用机制研究，筛选出具有抗真菌新药开发潜力的小分子功能模体。..3 主要内容、重要结果及关键数据：.3.1 根据MAF-1抗真菌功能模体筛选：证实MAF-1的功能结构域具有独立的体外抗真菌活性，获得抗真菌小分子功能模体MAF-1A，序列含26个氨基酸，α线性螺旋结构，分子量3022.5Da，pI值9.23，碱性氨基酸占总氨酸的26.9%；对常见致病性酵母菌的MIC为0.1～0.8mg/mL、MFC为0.2～0.9mg/mL。..3.2 MAF-1A的抗真菌谱研究：除对白假丝酵母菌敏感株、耐药株外，还对对新生隐菌球、克柔念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠具有抑杀作用，抗菌谱较母分子MAF-1宽。..3.3 MAF-1A的理、化特性及稳定研究：在含有NaCl或MgCl2环境中，杀菌效果减弱；与胎牛血清及胰蛋白酶作用后部分丧失抗真菌活性。..3.4 MAF-1A的细胞毒性研究：无溶血活性；对人hBMSCs细胞无毒性作用；对Hela细胞表现出增殖抑制作用，与MAF-1A浓度增加呈正相关。..3.5 MAF-1A干预白假丝酵母菌致病作用研究： 可通过抑制白假丝酵母菌孢子萌发和芽管形成，降低真菌对人口腔黏膜上皮细胞粘附能力，从而影响其致病能力。..3.6 MAF-1A的抗真菌分子机制研究：MAF-1A不仅可以通过真菌细胞壁、细胞膜发挥作用，还可以直接作用核酸，影响白假丝酵母菌的蛋白质合成及能量代谢，表明MAF-1A可通过多靶点作用发挥抗白假丝酵母菌活性。..3.7 MAF-1A点突变模体筛选：采用氨基酸替换点突变，改造获得的多肽MAF-1C、MAF-1D抗菌活性提高，抗菌谱扩大，但溶血性有所增加。..4 科学意义：.本研究所得资料，为利用天然抗菌肽筛选小分子高成药潜能的功能模体提供了可行途径；为天然抗菌肽分子体内代谢与先天免疫效能模式研究提供了理论基础。