作用于白念珠菌CaN信号通路的寡聚酰胺小分子探针研究

白念珠菌耐药是抗真菌治疗失败的主要原因，白念珠菌钙调神经磷酸酶(CaN)通路与耐药性产生密切相关，我们的前期研究发现RTA2是CaN通路导致耐药的必需基因，但RTA2的调控机制仍不清楚。寡聚酰胺是一类能和DNA靶序列特异结合的小分子，我们曾设计合成了一类寡聚酰胺小分子能成功调控白念珠菌已知耐药基因CDR1的表达。该课题以生物信息学预测的CaN信号通路靶基因的调控元件5`-GCTGT-3`为靶序列，设计合成带荧光标记和不带荧光标记的两类寡聚酰胺小分子探针，首先用报告基因法筛选得到能特异调控RTA2表达的小分子探针，进一步用荧光标记小分子探针、激光共聚焦显微镜、Western bloting法，研究转录因子Crz1p的去磷酸化、小分子探针与DNA靶序列结合、RTA2的表达等分子事件发生机制，探索寡聚酰胺小分子选择性Knock-down CaN信号通路重要功能基因的分子机制和生物学意义。

钙调神经磷酸酶（calcineurin，CaN）是体内唯一依赖Ca2+/钙调素（calmodulin，CaM）的Ser/Thr磷蛋白磷酸酶，CaN信号通路在白念珠菌感受环境刺激、信号转导、其毒力及耐药方面均起关键作用。Crz1p（calcineurin in response zinc protein 1）是包含C2H2锌指结构域的转录因子，能够特异结合调控基因启动子上的特定元件CDRE（calcineruin-dependent response element）。芯片研究结果显示：利用CaCl2激活CaN通路，264条差异基因中发现有60条基因共同依赖于CaN和Crz1p，这些基因启动子上游均含有[5-G（C/T）GGT-3]序列。我们的研究证明RTA2是白念珠菌CaN通路的靶基因，CaN通路通过其靶基因RTA2调节对唑类药物的耐药性的形成；RTA2基因缺失及CaN通路被抑制时，唑类药物易对白念珠菌的细胞膜造成损伤；体内实验发现RTA2基因缺失后感染的小鼠接受氟康唑治疗后生存率显著增加，证明RTA2基因影响氟康唑治疗白念珠菌感染的效果。进一步研究发现，CaN信号通路转录因子CRZ1基因与其靶基因RTA2二者任意缺失，都会显著增加白念珠菌感染小鼠接受氟康唑治疗的生存率，证明RTA2基因以CaN信号通路依赖的方式影响氟康唑治疗白念珠菌感染的效果；在临床分离的白念珠菌中也证明RTA2基因表达水平高的菌株感染小鼠接受氟康唑治疗的生存率显著降低。利用报告基因法筛选发现RTA2基因启动子上游440至460bp和631至785bp都存在其转录调控结合位点，而生物信息学预测的CDRE序列位于440至460bp区间，因此我们设计合成了一系列能够特异结合该段序列的寡聚酰胺小分子化合物。利用实时定量PCR研究发现，寡聚酰胺分子与RTA2启动子结合效率一般，对RTA2基因表达水平的影响不大，提示可能有其他结合位点或其他的转录激活通路并未被寡聚酰胺分子封闭。