筑波链霉菌产他克莫司的代谢调控机制解析及定向改造

Tacrolimus is an important immunosuppressant produced during the typical Streptomyce secondary metabolic process, but its biosynthesis is dynamically interfered by the precursor synthesis and transcriptional regulation. This research will introduce the systems metabolic engineering strategies and be focused on the molecule mechanism and the metabolic evolution of tacrolimus biosynthesis. By integrating metabolomics and transcriptomics technologies, the gene expression profiles and the intracellular metabolite profiles during the critical metabolic phases will be analyzed. Then a genome scale metabolic network model based on the constraints of metabolomics and transcriptomics data will be constructed and used to predict the potential engineering targets. These systematical analyses will dissect the metabolic regulation of tacrolimus biosynthesis, and predict the limiting pathways and the key metabolic nodes closely related to tacrolimus biosynthesis. Finally, by metabolic engineering technology including the gene overexpression, rescuing and deletion, the key nodes/pathways will be genetically modified and strengthened. This research will provide a theoretical basis and engineering strategy for the construction of efficient cell factories of tacrolimus.

他克莫司是一种重要的免疫抑制剂，生产于链霉菌的典型次级代谢过程，而其合成受到前体代谢、转录调控等因素的动态干扰。本研究拟采用系统代谢工程策略，针对他克莫司生物合成过程中的分子机制进行解析并完成代谢优化。通过整合代谢组、转录组及代谢网络构建技术，着重分析关键代谢时期与他克莫司合成密切相关的基因表达谱及胞内前体代谢物轮廓，并构建基于代谢组和转录组数据约束下的基因组尺度代谢网络模型，系统阐明他克莫司生物合成中代谢调控机制，预测并验证他克莫司合成的限速途径和关键节点，之后采用代谢工程技术对关键节点/途径进行强化、回补或敲除。本研究将建立定向调控他克莫司合成的工程策略，并为构建他克莫司高效合成的细胞工厂提供理论依据和技术手段。

他克莫司是一种降低器官移植后免疫排斥的一线临床药物，具有优良的生物学活性和广阔的市场前景。自1994年被批准上市以来，他克莫司的生产仍然依赖于筑波链霉菌的生物合成，效率低下，成本高昂。为揭示和解除菌株合成他克莫司的限制性瓶颈，本项目分三步对筑波链霉菌合成他克莫司的分子机制进行解析并进行代谢优化：1）整合诱变技术与神经网络模型-遗传算法的高通量筛选技术，获得1株稳定遗传的他克莫司高产菌株，并重新设计了发酵培养组分；2）通过整合代谢组-转录组-代谢网络分析技术，比较了原始菌株与高产菌株在他克莫司合成中密切相关的胞内基因表达谱及前体代谢物轮廓，构建了基因组尺度代谢网络模型，揭示了他克莫司生物合成中代谢调控机制，预测了他克莫司合成的限速途径例如甲基丙二酸合成，脂肪酸合成，乙醛酸循环等；3）采用代谢工程技术对上述节点进行强化或者弱化，建立了定向调控他克莫司合成的工程策略，最终获得产量高达600 mg/L以上的基因工程菌株，较出发菌株产量提高11倍。本项目的实施为构建他克莫司高效合成的细胞工厂提供理论依据和技术手段。