中华绒螯蟹螺原体黏附蛋白ALP41与宿主血细胞互作蛋白的筛选及其功能研究

Spiroplasma eriocheiris is a novel pathogen and cause the tremor disease of Chinese mitten crab, Eriocheir sinensis. Adhesion like protein ALP41 was certificated to be an important protein in adhesion and infection of S. eriocheiris in former studies. But the interaction mechanism between S. eriocheiris and its target cell (hemocyte) is not clear now. So we will try to screen and identify interaction proteins of S. eriocheiris ALP41 in E. sinensis hemocytes in this project. Firstly, the interaction protein will be screened by Yeast Two-Hybrid and His-Pull Down techniques. Secondly, interaction protein will be identified by Co-Immunoprecipitation and Far-Western Blotting techniques. Lastly, the functions of interaction proteins will be studied by the following three methods: 1) the function of interaction proteins in S. eriocheiris infection by Cross-Neutralization Test; 2) the interaction proteins positioning by immuno-fluorescence technique; 3) silence the interaction protein of ALP41 in hemocyte by RNAi. The interaction mechanism between S. eriocheiris ALP41and E. sinensis hemocyte will be confirmed by this study. The result will help us to study the infection mechanism of S. eriocheiris, which can be used in preventing the E. sinensis tremor disease.

中华绒螯蟹螺原体是近年来发现的一种引起虾蟹重大病害的新型病原微生物，前期研究证实其黏附蛋白ALP41在侵染和致病过程中起重要的作用，血细胞是螺原体侵染的靶细胞，然而螺原体与宿主靶细胞的相互作用机制目前还不清楚，本项目将筛选ALP41与宿主血细胞互作蛋白并进行功能研究。首先应用酵母双杂交和His-Pull Down技术筛选确定ALP41在宿主血细胞上的互作蛋白；而后通过免疫共沉淀、Far-Western Blotting技术验证蛋白互作；最后在三个方面研究互作蛋白的功能：1）交叉中和实验研究互作蛋白在螺原体感染宿主过程中的作用；2）免疫荧光技术对互作蛋白进行定位；3）RNA干扰技术沉默互作基因后宿主对螺原体感染的反应。经过以上研究确定ALP41与宿主细胞的互作蛋白和功能，为进一步研究螺原体的分子致病机制奠定基础，也为更有效地防治螺原体疫病提供理论依据。

本项目自批准以来，本项目基本上按照原有技术路线进行，但是也存在一些变动。项目本计划采用酵母双杂交方法筛选中华绒螯蟹螺原体黏附蛋白（SeALP）与中华绒螯蟹血细胞之间的互作蛋白，并计划对功能进行验证和信号通路研究。首先证明SeALP为一种膜蛋白，然后证明SeALP在感染过程中起到重要的作用。但是本项目在成功建立中华绒螯蟹血细胞文库后未能通过酵母双杂交筛选到能与SeALP相互作用的阳性克隆，分析可能是由于中华绒螯蟹血细胞文库重复序列过多、不能筛选膜蛋白等原因造成，因此本项目转向筛选SeALP与小鼠之间的互作蛋白，首先通过酵母双杂交筛选到可以与SeALP相互作用的23条测序，得到12个小鼠基因，而后选择EIF 2进行全长表达、KLHL 10和FBLN 7进行部分片段表达，进而利用Far-western blot证明SeALP可以与FBLN 7（包括两个EGF结构域）互作，同时激光共聚焦证明含有SeALP的质粒与含有FBLN 7的质粒可以在细胞中共定位。人工合成FBLN 7的另外一个EGF和CCP结构域后，Far-western blot证明SeALP只能与EGF结构域互作，因此证明SeALP是通过与EGF结构域互作而与FBLN 7蛋白相互作用的。重组表达的SeALP刺激小鼠细胞后ERK的磷酸化水平降低，这与螺原体感染小鼠细胞后ERK的磷酸化水平降低相似，这也进一步证明SeALP与EGF结合后影响EGFR通路。本项目证明FBLN 7在胚胎中大量表达，乳鼠脑和眼睛中表达量逐渐降低，成鼠脑和眼睛中没有表达，但是感染螺原体后产生白内障的成鼠脑和眼睛中都有表达，进一步证明SeALP与FBLN 7的互作与螺原体的感染相关。同时本项目并没有放弃筛选SeALP与中华绒螯蟹血细胞之间的互作蛋白，通过Far western blotting鉴定到多个蛋白，选择其中的Serine protease、甘露糖结合蛋白、组织蛋白酶 D进行基因克隆和蛋白表达，正在制备多克隆抗体，下一步采用细胞共定位和Far-western blotting验证它们与SeALP的相互作用，并用抗体中和试验、MTT试验对互作蛋白的功能进行研究，并利用RNA干扰技术研究这些受体蛋白所在信号通路在螺原体感染过程中的作用。